Comience colocando los cadáveres de larvas de drosophila marcados con anticuerpos en PBST al 0,2 % en un portaobjetos de vidrio. Se ajusta bajo el microscopio estereoscópico, asegurando que la superficie interna del cadáver de la larva esté hacia arriba. Absorba el exceso de solución de PBST con una toallita.
A continuación, añade delicadamente una gota de medio de montaje Anti-Fade. A continuación, coloque un cubreobjetos en el portaobjetos que cubra las larvas diseccionadas lenta y suavemente, evitando la formación de burbujas. Asegure la funda en su lugar aplicando esmalte de uñas alrededor de sus bordes.
Guarde el portaobjetos en un lugar oscuro para minimizar la atenuación fluorescente. Para la adquisición de imágenes, utilice el microscopio confocal de barrido láser con el objetivo de inmersión en aceite 63x. A continuación, ajuste la longitud de onda y la potencia del láser para que se ajusten mejor a los requisitos del experimento.
Para identificar las uniones neuromusculares y capturar imágenes del músculo cuatro en el segmento A tres, seleccione un láser de 488 nanómetros para activar la tubulina alfa o Futsch, y de 546 nanómetros para activar la pista de imágenes HRP. Modifique los parámetros para lograr un tamaño de fotograma de 1.024 x 1.024 píxeles, un zoom digital de 1,0 y un intervalo de imagen de 0,8 micrómetros. Para visualizar los microtúbulos en el músculo, capture imágenes del músculo dos en los segmentos A tres a A cinco, ya que tiene menos ramas traqueales.
Elija un láser de 488 nanómetros para activar la tubulina alfa y un láser de 633 nanómetros para activar la pista de imágenes T3605. Ajuste los parámetros de imagen a un tamaño de fotograma de 1.024 x 1.024 píxeles, un zoom digital de 2,0 y un intervalo de imagen de 0,4 micrómetros. Las organizaciones de microtúbulos pre y postsinápticos de la unión neuromuscular se marcaron con anti-alfa tubulina.
La tinción de Futsch reflejó la abundancia de microtúbulos estables en las neuronas presinápticas. Se observó una disminución de la intensidad de la señal de anti-Futsch cuando los microtúbulos que cortan la proteína Katanina 60 se sobreexpresaron en las neuronas presinápticas. La intensidad de tinción del tronco axónico fue más fuerte que la de las ramas.
Las mutaciones en Katanin 60 dieron lugar a un aumento de los bucles de microtúbulos. La sobreexpresión de Katanin 60 causó fragmentos cortos de microtúbulos dentro de los botones terminales. La tinción de alfatubulina demostró una clara red de microtúbulos alrededor del núcleo.
Las células musculares tenían un aumento significativo de la intensidad microtubular perinuclear y exhibían haces más fuertes en el mutante Katanin 60. La sobreexpresión dio lugar a la fragmentación de las fibras de los microtúbulos.
