אנו מודים לד"ר יינג שיונג על הדיונים וההערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) ל- C. M. (31500839).

1. דיסקציה של זחלים
הערה: תמיסת הניתוח תמיסת מלח דמוית המולימפה (HL3.1)18 ותמיסת הקיבוע 4% פרפורמלדהיד (PFA)19,20 משמשים בטמפרטורת החדר מכיוון שהמיקרוטובולים מתפרקים כאשר הטמפרטורה נמוכה מדי.
<ol><li>בחר זחל נודד 3rd instar עם מלקחיים קהים ארוכים. שטפו אותו עם HL3.1 והניחו אותו על צלחת הדיסקציה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. הערה: זחל נודד 3rd instar מזוהה על ידי spiracle קדמי מסועף וזוחל סביב הצינור בערך 96 שעות (25 ° C)21.</li>
	<li>מקמו את הזחל עם הצד הגבי או הגחוני כלפי מעלה. זהה את הצד הגבי על ידי שתי קנה הנשימה הארוך ואת הגחון על ידי חגורות הדנטיקולה הבטן.<ol><li>בהתאם לרקמה להתבונן, לבחור דיסקציה גבית או גחון. זה יאפשר תצוגה מדויקת ומפורטת יותר של תחום העניין הספציפי. עבור NMJ ותצפית תאי שריר, חתכו את אזורי הזחל, הגב והגחון, בהתאמה.</li>
	</ol></li>
	<li>נעצו את ווי הפה ואת הזנב. כוונן את הפינים כדי לשמור על הזחל במצב מורחב. הוסיפו טיפה של HL3.1 לזחל כדי למנוע ממנו להתייבש. הערה: Ca2+ -free HL 3.1 ניתן להשתמש כדי למזער את התכווצות השרירים במהלך דיסקציה.</li>
	<li>השתמש במספריים המנתחים כדי לבצע חתך רוחבי קטן קרוב לקצה האחורי, אך אל תחתוך את הקצה האחורי. לאחר מכן חותכים לאורך קו האמצע הגחוני לכיוון הקצה הקדמי.</li>
	<li>הכניסו ארבע סיכות חרקים בארבע פינות הזחל. התאימו מחדש את סיכות החרקים כך שהזחל יימתח באופן מקסימלי לכל הכיוונים.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי להסיר איברים פנימיים מבלי לפגוע בשרירים.</li>
</ol>2. קיבעון
<ol><li>הוסף 100 μL של PFA (4%) כדי לטבול פגרים במשך 40 דקות כאשר הפגרים עדיין נעוצים על צלחת הניתוח. אזהרה: אמצעי הגנה יעילים ננקטים כדי למנוע מגע ישיר עם העור או שאיפה, שכן PFA מהווה סכנה.</li>
	<li>פרקו את הפינים והעבירו את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל. יש לשטוף את PFA במי מלח חוצצים פוספט 1x המכיל 0.2% Triton X-100 (0.2% PBST) כדי למלא צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל למשך 10 דקות על שייקר הסרת הצבע במהירות 15 סל"ד. חזור על תהליך הכביסה 5x.</li>
</ol>3. אימונוציטוכימיה
<ol><li>יש לטבול את הפגרים בחומר חוסם (סרום עיזים 5% ב-0.2% PBST) ולחסום למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את החומר החוסם והחלף אותו ב- 200 μL של הנוגדן הראשוני (למשל, אנטי α-טובולין, 1:1000; אנטי פוטש, 1:50) מדולל עם 0.2% PBST ב 4 ° C למשך הלילה. לדמיין microtubules שריר על ידי immunostaining עם חד שבטי אנטי α-tubulin. Anti-Futsch יכול לשקף בעקיפין את המורפולוגיה microtubule ב NMJ.</li>
	<li>לאחר הדגירה של הנוגדן הראשוני, יש לשטוף את הזחלים עם 0.2% PBST למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 5x.</li>
	<li>לדגור על הזחלים עם 200 μL של נוגדן משני (למשל, עז נגד עכבר-488, 1:1000) מדולל עם 0.2% PBST בטמפרטורת החדר במשך 1.5 שעות בחושך.</li>
	<li>לאחר מכן, הוסיפו צבע גרעיני כגון TO-PRO(R) 3 יודיד (T3605) בריכוז של 1:1000 לתוך צינור הדגירה למשך 30 דקות בעת צביעת המיקרוטובולים בחושך20,22.</li>
	<li>יש לשטוף את הנוגדן המשני ואת הצבע הגרעיני עם 0.2% PBST למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 5 פעמים בחושך.</li>
</ol>4. הרכבה
<ol><li>הניחו את פגר הזחל ב-0.2% PBST על מגלשת זכוכית והתאימו אותו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. ודא שהמשטח הפנימי של פגר הזחל פונה כלפי מעלה וכל פגרי הזחל מסודרים כרצונך.</li>
	<li>יש לספוג את עודפי תמיסת PBST בעזרת מגבון ולהוסיף בעדינות טיפה של אמצעי הרכבה נגד דהייה.</li>
	<li>הניחו פתק כיסוי על המגלשה כדי לכסות את הזחלים המנותחים לאט ובעדינות כדי למנוע בועות.</li>
	<li>יש למרוח לק סביב הכיסוי. מקם את המגלשה בחלל החשוך כדי להפחית את הנחתת הפלואורסצנט.</li>
</ol>5. רכישת תמונות
<ol><li>כדי לקבל את התמונות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, בחר את מטרת טבילת השמן 60x (צמצם מספרי 1.42) או דומה, והתאם את עוצמת הלייזר ואורך הגל בהתבסס על הניסוי.</li>
	<li>כדי לזהות את ה-NMJ, צלמו תמונות בשריר 4 במקטע A3 (כפי שמוצג במיקום באיור 1F). בחר מדפסת לייזר של 488 ננומטר כדי להפעיל את α-tubulin או Futsch ו- 543 ננומטר כדי להפעיל את מסלול ההדמיה של HRP. התאימו את הפרמטרים לגודל מסגרת של 800 פיקסלים x 800 פיקסלים, זום דיגיטלי של 2.0 ומרווח הדמיה של 0.8 מיקרומטר ב-NMJ (איור 2).</li>
	<li>כדי לזהות את המיקרוטובולים בשריר, צלמו תמונות של שריר 2 במקטע A3-A5 (כפי שמוצג במיקום באיור 1G), מאחר שיש לו פחות ענפים בקנה הנשימה. בחר לייזר 488 ננומטר להפעלת α-טובולין ולייזר 635 ננומטר להפעלת מסלול ההדמיה T3605. התאימו את הפרמטרים לגודל מסגרת של 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים, זום דיגיטלי של 3.0 ומרווח הדמיה של 0.4 מיקרומטר בתאי שריר (איור 3).</li>
</ol>

צפייה ברשתות מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה ובתאי שריר

<ol>
	<li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins.">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224 (2006).</li><li>S&#225;nchez, C., D&#237;az-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function.">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li><li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAP2/Tau+family+of+microtubule-associated+proteins.">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204 (2005).</li><li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-severing+enzymes.">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li><li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-depolymerizing+kinesins.">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li><li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer's+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding.">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li><li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+morphogenesis,+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila.">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li><li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch/22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development.">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li><li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Kl&#228;mbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth.">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li><li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron.">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge.">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li><li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro.">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).</li><li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro.">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488 (2023).</li><li>H&#246;&#246;g, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends.">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster.">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila.">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila.">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li><li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation.">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li><li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202 (2011).</li><li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly.">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hereditary+spastic+paraplegia+gene,+spastin,+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function.">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן מתואר פרוטוקול לדיסקציה וצביעה חיסונית של דרוזופילה , זחלים, צמתים עצביים-שריריים ותאי שריר. ישנן מספר נקודות חיוניות שיש לקחת בחשבון. ראשית, הימנעות מפגיעה בשרירים הנצפים היא חיונית במהלך תהליך הדיסקציה. ייתכן שכדאי לתקן את הפילה לפני הסרת איברים פנימיים כדי למנוע מגע ישיר בין ה?...

מיקרוטובולים (MTs), כאחד המרכיבים המבניים של השלד הציטו-שלד, ממלאים תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל חלוקת תאים, גדילה ותנועתיות של תאים, הובלה תוך-תאית ושמירה על צורת התא. דינמיקה ותפקוד של מיקרוטובולים מווסתים על ידי אינטראקציות עם חלבונים אחרים, כגון MAP1, MAP2, טאו, קטנין וקינסין 1,2,3,4,5.
בנוירונים, מיקרוטובולים חיוניים להתפתחות ותחזוקה של אקסונים ודנדריטים. הפרעות במיקרוטובולים מובילות לתפקוד לקוי ואפילו למוות של נוירונים. לדוגמה, במוחם של חולי אלצהיימר, זרחן יתר של חלבון טאו מפחית את יציבות רשת המיקרוטובולים, וגורם לאי סדירות נוירולוגית6. לפיכך, בחינת רשתות מיקרוטובולים תתרום להבנת ההתפתחות העצבית והפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות.
הצומת העצבית-שרירית (NMJ) היא סינפסה היקפית הנוצרת בין מסוף אקסון נוירון מוטורי לבין סיב שריר, שהיא מערכת מודל מצוינת ורבת עוצמה לחקר המבנה והפונקציות הסינפטיות7. פוטש הוא חלבון בדרוזופילה שהוא הומולוגי לחלבון קושר המיקרוטובולים MAP1B שנמצא ביונקים8. הוא מתבטא רק בתאי עצב וממלא תפקיד בהתפתחות הכפתורים הסינפטיים 8,9 של NMJ. בצרורות נימה מסוג פראי שרצים לאורך מרכז תהליכי NMJ מדמיינים על ידי הכתמה חיסונית עם אנטי-פוטש. כאשר מגיעים לקצה של NMJ, צרור זה יש את היכולת או ליצור לולאה המורכבת microtubules או לאבד את המבנה נימה שלה, וכתוצאה מכך מראה מפוזר ניקוב10. לולאות מיקרוטובולים קשורות לקונוסי גדילה מושהים, מה שמרמז על כך שמערך המיקרוטובולים יציב11. לכן, אנו יכולים לקבוע בעקיפין את התפתחות המיקרוטובול היציב ב- NMJ על ידי צביעת פוטש. הגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובול. הגורמים המשפיעים על יציבות רשת המיקרוטובולים ניתן למצוא על ידי ניתוח הצפיפות והצורה של מיקרוטובולים. במקביל, ניתן להצליב את מצב רשת המיקרוטובולים של תאי שריר עם התוצאה של NMJ כדי לקבל מסקנות מקיפות יותר.
פרוטוקולים רבים שימשו לחקר הרשת והדינמיקה של מיקרוטובולים. עם זאת, מחקרים אלה התמקדו לעתים קרובות במחקרי מבחנה 12,13,14,15,16. לחלופין, כמה ניסויים in vivo השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לזהות את שלד הציטו-שלד17. על פי הקישור הספציפי של נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית או צבעים כימיים לחלבונים או לדנ"א, השיטות המוצגות כאן מאפשרות זיהוי של רשתות מיקרוטובולים ב- NMJ ברמה של נוירונים בודדים in vivo, עם תוצאות שאומתו על ידי תצפיות בתאי שריר. פרוטוקול זה הוא פשוט, יציב וניתן לחזרה כאשר הוא משולב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה הזמינים ב- Drosophila melanogaster, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות פנוטיפיות ובדיקות גנטיות לתפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A30104</td>
			<td>dilute 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>66vision</td>
			<td>54138B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Futsch antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank&#160;&#160;</td>
			<td>22C10</td>
			<td>dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-20955</td>
			<td>Final concentration: 4% in PB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Minutien Pins</td>
			<td>Entomoravia</td>
			<td></td>
			<td>0.1mm Diam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope SMZ161</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscopic fluorescence microscope BX41</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated goat anti-HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>dilute 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO(R) 3 iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer decoloring shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell lab instruments</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers&#160;</td>
			<td>dumont</td>
			<td>500342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using drosophila larval neuromuscular junction and muscle cells to visualize microtubule network

רשת המיקרוטובולים היא מרכיב חיוני במערכת העצבים. מוטציות בחלבוני בקרה רבים של מיקרוטובולים קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירולוגיות, כגון חלבון טאו הקשור למיקרוטובולים למחלות נוירודגנרטיביות, חלבון ניתוק מיקרוטובולים ספסטין וקטנין 60 גורמים לשיתוק ספסטי תורשתי ולהפרעות נוירו-התפתחותיות, בהתאמה. זיהוי רשתות מיקרוטובולים בנוירונים הוא יתרון להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות. עם זאת, הגודל הקטן של תאי עצב והסידור הצפוף של צרורות מיקרוטובולים אקסונליים הופכים את הדמיה של רשתות המיקרוטובולים למאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה לדיסקציה של הצומת העצבית-שרירית של הזחל ותאי שריר, כמו גם צביעה חיסונית של α-טובולין וחלבון Futsch הקשור למיקרוטובול כדי לדמיין רשתות מיקרוטובולים בדרוזופילה מלנוגסטר. הצומת העצבית-שרירית מאפשרת לנו לצפות הן במיקרוטובולים קדם-סינפטיים והן לאחר סינפטיים, והגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובולים. כאן, על ידי מוטציה וביטוי יתר של קטנין 60 בדרוזופילה מלנוגסטר, ולאחר מכן בחינת רשתות המיקרוטובולים בצומת העצבית-שרירית ובתאי השריר, אנו חושפים במדויק את תפקיד הבקרה של קטנין 60 בהתפתחות עצבית. לכן, בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

Microtubules (MTs), as one of the structural components of the cytoskeleton, play an important role in diverse biological processes, including cell division, cell growth and motility, intracellular transport, and the maintenance of cell shape. Microtubule dynamics and function are modulated by interactions with other proteins, such as MAP1, MAP2, Tau, Katanin, and Kinesin1,2,3,4,5.
In neurons, microtubules are essential for the development and maintenance of axons and dendrites. Abnormalities in microtubules lead to dysfunction and even the death of neurons. For instance, in the brain of Alzheimer&#39;s patients, Tau protein hyperphosphorylation reduces the stability of the microtubule network, causing neurological irregularities6. Thus, examining microtubule networks will contribute to a comprehension of neurodevelopment and the pathogenesis of neurological diseases.
The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse formed between a motor neuron axon terminal and a muscle fiber, which is an excellent and powerful model system for studying synaptic structure and functions7. Futsch is a protein in Drosophila that is homologous to the microtubule-binding protein MAP1B found in mammals8. It is expressed only in neurons and plays a role in the development of the NMJ&#39;s synaptic buttons8,9. In wild-type, filamentous bundles that run along the center of NMJ processes are visualized by immunostaining with anti-Futsch. When reaching NMJ&#39;s end, this bundle has the ability to either form a loop consisting of microtubules or to lose its filamentous structure, resulting in a diffuse and punctate appearance10. Microtubule loops are associated with paused growth cones, which suggests the microtubule array is stable11. Therefore, we can indirectly determine the stable microtubule development in NMJ by Futsch staining. The large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. The factors affecting the stability of the microtubule network can be found by analyzing the density and shape of microtubules. Simultaneously, the microtubule network status of muscle cells can be cross-verified with the result of NMJ to obtain more comprehensive conclusions.
Many protocols have been employed for investigating the network and dynamics of microtubules. However, these researches have often focused on in vitro studies12,13,14,15,16. Alternatively, some in vivo experiments have employed electron microscopy to detect the cytoskeleton17. According to the specific binding of fluorescently labeled antibodies or chemical dyes to proteins or DNA, the methods presented here allow the detection of microtubule networks in NMJ at the level of individual neurons in vivo, with results corroborated by observations in muscle cells. This protocol is simple, stable, and repeatable when combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and genetic screenings for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo.

מחבר זרקור: הבנת רשת מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים דרוזופילה 

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

Currently, microtubule dynamics are observed indirectly through microtubule-binding proteins such as EB1. Since alphabeta tubulin heterodimers are abundant in the cytoplasm, fold directly, neighboring tubulin heterodimers are lacking the dynamics of microtubule networks in vivo. Our protocol visualizes microtubules in neuromuscular synapses and muscle cells.When combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and the genetic screening for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo. Our research focuses on the relationship between the cytoskeleton and the neurodevelopment, as well as its implications for neurological diseases. We hope to discover the mechanism of neurodevelopment and the parthenogenesis for neurological diseases by highlighting the effect of cytoskeletal regulatory proteins on neurons.

הדגמנו הליך שלב אחר שלב להדמיית רשת המיקרוטובולים הן בצמתים עצביים-שריריים (NMJs) והן בתאי שריר. לאחר דיסקציה בהתאם לתרשים הסכמטי (איור 1A-E), מתבצעת צביעה חיסונית, ולאחר מכן התמונות נצפות ונאספות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי (איור 1F,G</...

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

כיום, דינמיקה של מיקרוטובולים נצפית בעקיפין באמצעות חלבונים קושרי מיקרוטובולים כגון EB1. מכיוון שהטרודימרים של טובולין אלפביתא נמצאים בשפע בציטופלסמה, מתקפלים ישירות, הטרודימרים טובולין שכנים חסרים את הדינמיקה של רשתות מיקרוטובולים in vivo. הפרוטוקול שלנו מדמה מיקרוטובולים בסינפסות עצביות-שריריות ובתאי שריר.בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה הזמינים ב- Drosophila melanogaster, מאפשרים מגוון רחב של בדיקות פנוטיפיות וסינון גנטי לתפקידם של חלבוני הבקרה של רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים in vivo. המחקר שלנו מתמקד בקשר שבין השלד העצבי לבין ההתפתחות העצבית, כמו גם בהשלכותיו על מחלות נוירולוגיות. אנו מקווים לגלות את מנגנון ההתפתחות העצבית ואת הפרתנוגנזה למחלות נוירולוגיות על ידי הדגשת ההשפעה של חלבוני בקרה ציטו-שלד על נוירונים.

using-drosophila-larval-neuromuscular-junction-muscle-cells-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

1.4K Views.  Hubei University. כיום, דינמיקה של מיקרוטובולים נצפית בעקיפין באמצעות חלבונים קושרי מיקרוטובולים כגון EB1. מכיוון שהטרודימרים של טובולין אלפביתא נמצאים בשפע בציטופלסמה, מתקפלים ישירות, הטרודימרים טובולין שכנים חסרים את הדינמיקה של רשתות מיקרוטובולים in vivo. הפרוטוקול שלנו מדמה מיקרוטובולים ...

Video: מחבר זרקור: הבנת רשת מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים דרוזופילה 

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Drosophila Larval Dissection and Fixation for Microtubule Visualization

Begin by picking out a wandering Drosophila third instar larva using long blunt forceps. Wash the larva with hemolymph-like saline, then dry it with a wipe. Next, position the larva dorsally or ventrally on a dissection dish under the stereo microscope.Depending on the tissue to be observed, opt for dorsal or ventral dissection. Pin the larva's mouth hooks and tail to maintain extended positioning. Next, add a drop of the hemolymph-like saline to prevent the larva from drying.Using dissection scissors, make a small transverse incision close to the posterior end without severing it completely. Proceed to cut along the ventral midline, moving toward the anterior end. Now insert four insect pins each into the corners of the larva.Make necessary adjustments to the insect pins to maximize the stretching of the larva. Use forceps to gently remove the internal organs while avoiding harm to the muscles. To fix the larva, immerse the carcasses in 100 L of 4%paraformaldehyde, while still affixed to the dissecting dish.After this, dismount the pins. Then transfer the sample into a 2 mL microcentrifuge tube filled with 0.2%PBST. Place the tube on a shaker for 10 minutes at 15 RPM.

דרוזופילה דיסקציה וקיבוע זחל להדמיית מיקרוטובולים

Immunohistochemistry of Drosophila Larva for Microtubule Visualization

Remove the PBST and immerse the paraformaldehyde-fixed drosophila larval carcasses in a blocking agent for 40 minutes at room temperature. Replace the blocking agent with 200 microliters of the primary antibody diluted with 0.2%PBST. Leave the larvae to incubate at four degrees Celsius overnight.The next day, wash the larvae with 0.2%PBST for 10 minutes. Next, remove the PBST from the tube and add 200 microliters of diluted secondary antibody. Incubate it at ambient temperature for 1.5 hours in the dark.Introduce a nuclear dye such as TO-PRO R 3 iodide into the incubating tube for 30 minutes while staining the microtubules in the dark. Finally, rinse off the secondary antibody and the nuclear dye with 0.2%PBST for 10 minutes.

אימונוהיסטוכימיה של זחל דרוזופילה להדמיית מיקרוטובולים

Mounting and Image Acquisition of Drosophila Larval Microtubules

Begin by placing the antibody labeled drosophila larval carcasses in 0.2%PBST on a glass slide. Adjusted under the stereo microscope, ensuring that the inner surface of the larval carcass is facing up. Absorb the excess PBST solution using a wipe.Then delicately add a drop of Anti-Fade mounting medium. Next place a cover slip on the slide covering the dissected larvae slowly and gently, avoiding bubble formation. Secure the cover slip in place by applying fingernail polish around its edges.Store the slide in a dark location to minimize fluorescent attenuation. For image acquisition, use the laser scanning confocal microscope with the 63x Oil immersion objective. Then adjust the wavelength and laser power to fit the requirements of the experiment best.To identify the neuromuscular junctions and capture images of muscle four in segment A three, select a 488 nanometer laser to activate alpha tubulin or Futsch, and 546 nanometers to activate the HRP imaging track. Modify the parameters to achieve a frame size of 1, 024 by 1, 024 pixels, a digital zoom of 1.0, and an imaging interval of 0.8 micrometers. To visualize microtubules in the muscle, capture images of muscle two in the segments A three to A five as it has fewer tracheal branches.Choose a 488 nanometer laser for activating alpha tubulin and a 633 nanometer laser for activating the T3605 imaging track. Adjust the imaging parameters to a frame size of 1, 024 by 1, 024 pixels, a digital zoom of 2.0, and an imaging interval of 0.4 micrometers. Both pre-and post-synaptic microtubule organizations of the neuromuscular junction were labeled with anti-alpha tubulin.Futsch staining reflected the abundance of stable microtubules in the pre-synaptic neurons. Decreased signal intensity of anti-Futsch was observed when microtubules severing protein Katanin 60 was overexpressed in the presynaptic neurons. The staining intensity of the axon trunk was stronger than that of the branches.Katanin 60 mutations resulted in increased microtubule loops. Overexpression of Katanin 60 caused short microtubule fragments within the terminal buttons. Alpha tubulin staining demonstrated a clear network of microtubules around the nucleus.Muscle cells had a significantly increased perinuclear microtubular intensity and exhibited stronger bundles in the Katanin 60 mutant. Overexpression resulted in fragmentation of the microtubule fibers.