Comience disolviendo 0,0005 gramos de NBT en 10 microlitros de DMSO. Después de agitar el vórtice durante 15 minutos, agregue 90 microlitros de la solución salina equilibrada de Hank o HBSS con calcio y magnesio y un microlitro de las sustancias de prueba. De nuevo, haz vórtice en el tubo durante un máximo de dos minutos.
Para realizar la prueba de portaobjetos NBT, mezcle suavemente y transfiera dos microlitros de los neutrófilos polimorfonucleares activados previamente preparados a un portaobjetos de vidrio limpio. Incubar el portaobjetos en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, agregue un microlitro de la solución de trabajo NBT sobre las células.
Incubar de nuevo durante 20 minutos, protegiendo de la luz. Después de secar el portaobjetos, fíjelo aplicando una gota de metanol en cada pocillo durante un minuto. Tiñe el portaobjetos con 0,03 safranina durante un minuto más.
En cada pocillo, cuente 100 células al azar, diferenciando los neutrófilos con y sin depósitos de formazano. Para realizar el ensayo de espectrofotometría NBT, mezcle suavemente y transfiera 90 microlitros de los neutrófilos polimorfonucleares activados previamente preparados a un tubo de microcentrífuga limpio. A continuación, agregue con cuidado 20 microlitros de una solución NBT de seis milimolares e incube el tubo en la oscuridad durante 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Después de la incubación, agregue 100 microlitros de SDS al 10% y Vortex. Sonicate con una punta sonicate al 60% de amplitud, añadiendo cinco ciclos de 15 segundos cada uno e intervalos de 15 segundos. Centrifugar a 12.000 g durante cinco minutos.
Transfiera 60 microlitros de sobrenadante a una placa de fondo transparente de 96 pocillos y mida la absorbancia del producto sobrenadante a 570 nanómetros. Los resultados del ensayo espectrofotométrico indicaron que 100 nanomolares de PMA indujeron una producción elevada de ROS en comparación con los grupos fMLP y control. Los resultados de la prueba de portaobjetos NBT corroboraron los resultados espectrofotométricos, mostrando a PMA como el estímulo más intenso que induce la producción de ROS en comparación con fMLP.
