El apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (otorga GM092804, DE019938) y el Hospital Shriners Burns.

1. Fabricación de dispositivos de microfluidos <ol><li> Utilizando técnicas de fotolitografía estándar, fabricar el molde de la oblea maestro en una clase 1000 habitación limpia. Patrón de la primera capa de resina fotosensible 3-m-delgada a base de epóxido negativo para definir los canales de migración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Patrón de la segunda capa de 50 micras de espesor para definir las cámaras de células de carga y de quimiocinas. </li><li> Utilice la oblea con dibujos para echar polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos. Vigorosamente la mezcla de PDMS (20 g) con iniciador (2 g) durante 5 min usando tenedor de plástico en gran bandeja de pesada de plástico. </li><li> Vierta cuidadosamente PDMS en molde. </li><li> Desgasificar la PDMS mediante la colocación de molde con PDMS vierte en un desecador de vacío durante 1 hora. </li><li> Hornear y curar PDMS dispositivos de microfluidos para al menos 3 horas en un horno a 65 ° C. </li><li> Rompa las WBLCs centrales utilizando un golpeador con un diámetro de la punta de 1,5 mm. </li><li> Rompa los dispositivos en forma de rosquilla enteros usando una punciónella con un diámetro de la punta de 5,0 mm. </li><li> Remueva las partículas de los dispositivos de rosquilla con cinta adhesiva. </li><li> Enjuague una placa de 12 pocillos con agua desionizada y secar con nitrógeno. Colocar la placa en el horno 60 ° C durante 5 min. </li><li> El plasma de oxígeno a tratar la placa de 12 pocillos dos veces; una vez solo por 35 segundos y luego otra vez con los dispositivos de donuts para otros 35 seg. </li><li> Coloque con cuidado los dispositivos en los pocillos de la placa con unas pinzas. </li><li> Placa Hornear con dispositivos unidos en una placa caliente ajustada a 80 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. Microfluidic Preparación del ensayo <ol><li> Dispositivos de microfluidos Prime inmediatamente después del tratamiento con plasma de oxígeno, cuando el dispositivo es hidrófilo y efectos capilares puede promover el cebado de los pequeños canales en el dispositivo. </li><li> Cree solución quimioatrayente mezclando 5 l fMLP [solución madre 10 mM] con 5 l fibronectina [solución madre de 1 mg / ml] y 490 l HBSS. </li><li> Lentamente pipeta &amp; #160; solución quimioatrayente en WBLC, usando una punta de carga de gel (Figura 1A). Pipet un adicional de 20 l de la quimioatrayente alrededor del exterior del dispositivo. </li><li> Colocar la placa en un desecador durante 15 min. Mediante la aplicación de un vacío en el dispositivo, la solución se instila en los canales laterales del dispositivo y el aire desplazado difundido fuera a través de los PDMS. </li><li> Retire la placa de desecador y confirmar la humectación de canal del dispositivo bajo el microscopio. Mira como la burbuja se hace más pequeño como solución quimioatrayente entra en la cámara. Sin burbuja debe estar presente en el dispositivo después de un tratamiento de vacío. </li><li> Lavar el WBLC y fuera del dispositivo a fondo para eliminar el exceso de solución quimioatrayente. Este paso genera un gradiente de quimioatrayente de cada una de las cámaras de quimiotaxis focales (FCC) franceses al centro del dispositivo. <ol><li> Llene una jeringa de 1 ml con PBS, añadir una punta de aguja roma 30 G a la jeringa. Suavemente, inserte la punta de la aguja de la jeringa enal centro del agujero de donut. Empuje suavemente 100 l de PBS en el agujero de manera que una gota de formas de PBS en la parte superior del dispositivo. </li><li> Placa de la inclinación y de pipeta 1 ml de PBS alrededor de dispositivo de modo que el líquido se acumula en la parte inferior del pozo. Aspirar el líquido y repetir el proceso para un total de 3 veces utilizando solución tampón fresca (uso de memoria en lugar de tampón si los neutrófilos separados serán cargados en los medios) 9. </li></ol></li><li> Llene cada pocillo con los medios de comunicación hasta las copas de los dispositivos están sumergidas bajo el líquido. Deje que los dispositivos se sientan durante 15 minutos para permitir la gradiente se estabilice. Los resultados experimentales y los datos teóricos de simulaciones de elementos finitos muestran que los gradientes en estos dispositivos son estables hasta 24 h para las pequeñas moléculas (por ejemplo, fMLP) y hasta un varios días de mayor peso molecular (por ejemplo, IL-8). </li><li> Utilizando puntas de carga de gel, con la pipeta lentamente 2 l de sangre (o neutrófilos aislados) en conjunto cada loa sangreDing cámara (WBLC) (Figura 1A). </li></ol> 3. Preparación de la muestra Los neutrófilos humanas De sangre capilar <ol><li> Recoger la sangre capilar del pinchazo en el dedo del voluntario sano, que está en ninguna inmunosupresores. Todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito, ya través de los procedimientos aprobados por el MGH y Shriners Juntas de Revisión Institucional. <ol><li> Para la recolección de la sangre pinchazo en el dedo, lavar las manos con agua y jabón y secar la piel. Preparar solución madre anti-coagulant/stain mediante la adición de 1 ml de HBSS + 0,2% de HSA y 10 l tinción de Hoechst (32,4 M) a la heparina tubo de recogida de sangre (1,65 USP/50 l de sangre). Pinchar el dedo utilizando una lanceta de seguridad SurgiLance (profundidad de 2,2 mm, 22 G), limpie primera gota de sangre y recoger 50 l de sangre en un tubo Eppendorf que contiene la acción anticoagulante y solución de tinción fluorescente Hoechst (10 l) y suavemente mezclar. </li></ol></li&gt; <li> Incubar la sangre y tinción de Hoechst durante 10 min para permitir la tinción fluorescente núcleo. Ejecute la muestra dentro de 1 hora de la recogida de sangre. </li></ol> Los neutrófilos humanas De Sangre venosa <ol start="3"><li> Dibujar 10 ml de sangre periférica, venosa en tubos que contenían heparina USP 33. </li><li> Añadir 50 l de sangre venosa a los medios de comunicación y tinción de Hoechst como se describe anteriormente. Incubar la sangre y tinción de Hoechst durante 10 min para permitir la tinción fluorescente núcleo. Ejecute la muestra dentro de 1 hora de la recogida de sangre. </li></ol> Neutrófilos Separación De Sangre Entera - Control Positivo <ol start="5"><li> Para separar los neutrófilos, utilizar técnicas estériles para aislar los neutrófilos de la 10 ml de muestra de sangre entera venosa usando hetastarch (6% w / v) gradiente de densidad seguido de un kit de aislamiento de selección negativa con perlas magnéticas siguiendo el protocolo de los fabricantes. </li><li> Se resuspendieron la alícuota final del neutrófilos a una Concentración de 4.000 células / mu l en 1X HBSS + 0,2% de albúmina de suero humano. Mantener las células a 37 ° C hasta el momento de realizar el experimento. </li></ol> 4. Microscopia y Análisis de Imágenes para la quimiotaxis de neutrófilos Medidas <ol><li> Ajustar la temperatura biochamber a 37 ° C, humedad del 80% y CO 2 al 5%. </li><li> Comience obtener imágenes inmediatamente usando time-lapse en un microscopio (10X o mayor aumento). </li></ol> 5. Análisis estadístico <ol><li> Pista manualmente al menos 50 neutrófilos en cada muestra. </li><li> Contar las células que entran en la FCC con el tiempo (Figura 2). </li><li> Cálculo de las velocidades de neutrófilos en el canal entre WBLC y FCC usando ImageJ (NIH) (Figura 2). </li><li> Cuantificar la direccionalidad de los neutrófilos mediante el recuento del número de células que pasan a la bifurcación y el cálculo de la relación entre el número de células que se vuelven hacia la FCC y las células que la salida ªe dispositivo. Las células que no son direccionales no siguen el gradiente quimiotáctico y por lo tanto migran en números iguales hacia la FCC y el canal de salida (Figura 2). </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis.">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+kit-on-a-lid:+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays.">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions.">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li><li>Nauseef, W. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+human+leucocyte+subsets:+the+advantages+of+positive+selection+and+rapid+purification.">Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification.</a> BMC genomics. 8, (2007).</li><li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PloS one. 6, (2011).</li><li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood.">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).</li><li>Hoang, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis,+directly+from+a+droplet+of+whole+blood.">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. , 1-9 (2013).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns.">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li><li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses.">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li><li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma.">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de intereses a revelar.

En este trabajo, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos para medir la quimiotaxis de neutrófilos a partir de una gota de sangre (2 l). La filtración mecánica en el chip de los glóbulos rojos de la migración de neutrófilos activamente evita la necesidad de métodos engorrosos de separación de células tales como gradientes de densidad 10, la selección positiva 11, o selección negativa 12, que son propensos a introducir artefactos mediante la activación de los neutróf...

<html> El tráfico de neutrófilos juega un papel crítico en la determinación del progreso y la resolución de muchas condiciones inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis 1, la infección bacteriana o la sepsis 2, y lesiones por quemadura 3. Por su importante contribución a las condiciones de salud y enfermedad, el recuento de neutrófilos es parte del análisis de sangre estándar a menudo se considera en los laboratorios clínicos y de investigación. Sin embargo, a pesar de ser una de las pruebas más ubicuos, el valor de recuento de neutrófilos en el diagnóstico de la infección y la sepsis se ha cuestionado con frecuencia 4. Por ejemplo, un estudio de los neutrófilos en pacientes con quemaduras reveló que el recuento de neutrófilos y la función de la migración de neutrófilos no se correlacionan; lo que significa que el recuento de neutrófilos por sí sola no es un indicador preciso del estado inmunológico 3. Aunque más difícil de medir, la competencia funcional de neutrófilos ha sido propuesta como más valioso en una amplia gama de condiciones. t &quot;&gt; Es importante destacar que muchos de los defectos de neutrófilos son transitorias y no se activan por defectos genéticos permanentes, una distinción que se ha pasado por alto en gran medida en la clínica hasta hace poco. En el contexto de las lesiones por quemaduras, la migración de neutrófilos podría ser monitoreado durante el curso de tratamiento de un paciente como un indicador de estado inflamatorio o infección 3. ensayos de migración tradicionales utilizados actualmente en el laboratorio (cámara de Boyden, cámara de Dunn, ensayo de micropipeta) no se puede traducir en un entorno clínico, ya que requieren grandes volúmenes de sangre y engorroso que consume tiempo técnicas de aislamiento de neutrófilos (Tabla 1). Estos ensayos también pueden no ser usados ​​para monitorear los cambios transitorios en la quimiotaxis de neutrófilos en pequeños animales de laboratorio, tales como ratones, ya que el volumen de sangre necesaria para el aislamiento de neutrófilos permite sólo una muestra y, a menudo incluso requiere la puesta en común de sangre de múltiples animales para un único ensayo. Por ejemplo, un estudio que implicaba mcondiciones ultiple y tratamientos a través de múltiples puntos de tiempo potencialmente podrían requerir miles de ratones utilizando ensayos de quimiotaxis actuales. Esto restringe la investigación biológica básica que se puede hacer para comprender la compleja dinámica de la función inmune en el contexto de una lesión, infección o quemadura frecuentemente estudiado en los modelos murinos 5. Para abordar la necesidad de un ensayo funcional de neutrófilos que es rápido, robusto, mientras que requiere un mínimo de volumen de sangre, hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos que mide la quimiotaxis de neutrófilos directamente desde una pequeña gota de sangre entera. Se sabe que muchos factores en la sangre entera, incluyendo suero 6 y 7 plaquetas, afectan a la función de los neutrófilos. Por lo tanto, es beneficioso que todo el ensayo microfluídico sangre minimiza procesamiento de la muestra para mantener el microambiente in vivo de los neutrófilos en la medición de las variaciones en la quimiotaxis con un ensayo in vitro 8. Este enfoquereduce el tiempo de recogida de sangre para ensayos de migración de neutrófilos de horas utilizando técnicas tradicionales, a pocos minutos (Tabla 1). La plataforma de microfluidos sangre completa produce un gradiente lineal quimioatrayente estable para la duración del experimento, no tiene partes móviles, y no requiere una fuente de presión externa (es decir, bomba de jeringa). La característica clave en el diseño de todo el dispositivo de microfluidos sangre es la incorporación de un glóbulo rojo (RBC) de peine de filtración que filtra mecánicamente los glóbulos rojos de entrar en el canal de la migración del dispositivo. Los giros a la derecha de este peine filtración evitan la necesidad de filtración de exclusión de tamaño, lo que probablemente se atasca con los glóbulos rojos y por lo tanto bloquean el gradiente quimiotáctico de alcanzar los neutrófilos migran activamente en el BM. La incorporación de todo el dispositivo de microfluidos sangre en una placa de 12 o 24 pocillos facilita la detección de múltiples mediadores de Si la quimiotaxis de neutrófilos humana o murinasimultáneamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:179px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Device Fabrication</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">SU8&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:179px;">Y131273</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:191px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:179px;">Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Standard glass slides</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">125495</td>
			<td style="width:191px;">1 X 3 inches</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Glass-bottom plate</td>
			<td style="width:191px;">MatTek</td>
			<td style="width:179px;">P12G-1.5-14-F</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15081</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:179px;">15072</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Microfluidic Assay Preparation and Analysis</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Gel-loading pipet tip</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">02-707-139</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Syringe</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientfic</td>
			<td style="width:179px;">309602</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Blunt tip needle, 30g &#189; in.</td>
			<td style="width:191px;">Brico Medical Supply</td>
			<td style="width:179px;">BN3005</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Vacutainer, Heparin</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">HBSS&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Human serum albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">A5843-5G</td>
			<td style="width:191px;">0.2% final concentration in HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F0895-1MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">fMLP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:179px;">F3506-10MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;">SLN240</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Hoescht stain</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:179px;">H3570</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Positive Control&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HetaSep</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">7906</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit</td>
			<td style="width:191px;">STEMCELL Technologies Inc.</td>
			<td style="width:179px;">19257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Plasma Asher</td>
			<td style="width:191px;">March Instruments</td>
			<td style="width:179px;">P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Lindberg/Blue M Oven</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:179px;">13-258-30C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Stainless Steel Precision Tweezers</td>
			<td style="width:191px;">Techni Tool</td>
			<td style="width:179px;">758TW458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:179px;">08-594-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Dataplate Digital Hot Plate</td>
			<td style="width:191px;">Alpha Multiservices</td>
			<td style="width:179px;">PMC 720&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Nikon TiE inverted microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">MRH20101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon</td>
			<td style="width:191px;">Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">500-L200NI2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:211px;">DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters - 25mm Emitters</td>
			<td style="width:191px;">Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td style="width:179px;">31013v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600x1200 pixels</td>
			<td style="width:191px;">Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td>
			<td>RET-2000R-F-M-12-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed whole blood

Los neutrófilos desempeñan un papel esencial en la protección contra las infecciones y sus números en la sangre se miden con frecuencia en la clínica. Altos recuentos de neutrófilos en la sangre suelen ser un indicador de las infecciones en curso, mientras que los recuentos bajos de neutrófilos son una señal de advertencia para los mayores riesgos para las infecciones. Para llevar a cabo sus funciones, los neutrófilos también tienen que ser capaces de moverse con eficacia de la sangre donde pasan la mayor parte de su vida, en los tejidos, en los que se producen las infecciones. En consecuencia, cualquier defecto en la capacidad de los neutrófilos para migrar pueden aumentar los riesgos de infecciones, incluso cuando los neutrófilos están presentes en números apropiados en la sangre. Sin embargo, la medición de la capacidad de migración de los neutrófilos en la clínica es una tarea difícil, que requiere tiempo, requiere gran volumen de sangre, y el conocimiento de expertos. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos diseñado un robusto análisis de microfluidos para la migración de neutrófilos, que requiere una sola gota de sangre no procesada, circumrespiraderos la necesidad de la separación de neutrófilos, y es fácil de cuantificar en un microscopio sencillo. En este ensayo, los neutrófilos migran directamente de la gota de sangre, a través de pequeños canales, hacia la fuente de quimioatrayente. Para evitar que el flujo granular de células rojas de la sangre a través de los mismos canales, se implementó filtros mecánicos con ángulo de giros a la derecha que bloquean selectivamente el avance de las células rojas de la sangre. Hemos validado el ensayo comparando la migración de neutrófilos a partir de gotas de sangre de pinchazo en el dedo y la sangre venosa. También comparamos todo esto en la sangre (WB) con fuentes de la migración de neutrófilos a partir de muestras de neutrófilos purificados y encontramos la velocidad constante y direccionalidad entre las tres fuentes. Esta plataforma de microfluidos permitirá el estudio de la migración de neutrófilos humanos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de los neutrófilos en la salud y la enfermedad.

Todo el ensayo de quimiotaxis de neutrófilos en sangre (BM) se validó mediante la medición de la acumulación de neutrófilos hacia un gradiente de fMLP (Película S1). Los resultados confirman que los glóbulos rojos son atrapados por el peine de filtración, mientras que los neutrófilos (azul) son capaces de migrar activamente a cabo de toda la sangre (Figura 3A y la película de S1). El gradiente estable lineal quimioatrayente (verde), formada por todo el disposi...

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Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Este protocolo detalla un ensayo diseñado para medir la quimiotaxis de neutrófilos humanos a partir de una gotita de sangre entera con robusta reproducibilidad. Este enfoque evita la necesidad de la separación de neutrófilos y requiere sólo unos pocos minutos de ensayo de tiempo de preparación. El chip de microfluidos permite la medición repetida de la quimiotaxis de neutrófilos en el tiempo en los bebés o pequeños mamíferos, donde el volumen de la muestra es limitado.

Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K vistas.  Massachusetts General Hospital.  Este protocolo detalla un ensayo diseñado para medir la quimiotaxis de neutrófilos humanos a partir de una gotita de sangre entera con robusta reproducibilidad. Este enfoque evita la necesidad de la separación de neutrófilos y requiere sólo unos pocos minutos de ensayo de tiempo de preparación. El chip de microfluidos permite la medición repetida de la quimiotaxis de neutrófilos en el tiempo en los bebés o pequeños mamíferos, donde el volumen de la muestra es ...

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Investigación

Bioingeniería

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

Medio Ambiente Microfluidic controlada de Investigación Dinámica de agregación de glóbulos rojos

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una plataforma de microfluidos para la proyección de imagen Longitudinal en Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...