Este protocolo es significativo porque permite un análisis in vitro del enjambre de neutrófilos, que supera muchas limitaciones de nuestra incapacidad actual para experimentar. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un fácil acceso a las citoquinas y mediadores de lípidos secretados que los neutrófilos liberan durante el enjambre y permite el análisis cuantitativo de imágenes. Si bien aplicamos esta técnica a los neutrófilos, podría extenderse para analizar la migración de otros glóbulos blancos como monocitos y linfocitos T.
Comience preparando una polielectrolita catiónica de 1,6 miligramos por mililitro, o solución de CP, añadiendo la cantidad adecuada de polvo de CP al agua y mezclándolo en la placa de agitación durante la noche o hasta que todos los sólidos se disuelvan. Si lo desea, la solución se puede hacer fluorescente mediante la adición de poli-L-lisina etiquetada con FITC. Genere la oblea de silicio maestro utilizando procedimientos de fotolitografía estándar.
El diseño utilizado aquí es una matriz rectangular de cuatro por cuatro mililitros de círculos rellenos de 30 micrómetros de diámetro, con un centro de 150 micrómetros para el espaciado central, pero se puede modificar como se desee para diferentes aplicaciones. Recubrir una capa de 40 micrómetros de espesor de fotorresistente negativo en una oblea de silicio. Luego hornea la oblea a 65 grados Centígrados durante cinco minutos.
Y 95 grados Celsius durante 10 minutos. Exponga la oblea a la luz UV a través de una fotomasca cromada con 150 a 160 mililitros por centímetro cuadrado. Hornee la oblea de nuevo a 65 grados Centígrados durante cinco minutos y 95 grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, sumergirlo en el desarrollador de fotorresistsión durante 10 minutos. Y enjuáguelo con alcohol isopropílico. El patrón ahora debe ser visible en la oblea.
A continuación, mezcle a fondo una proporción de 10 a una proporción de polidimetilsiloxano, o PDMS, prepolímero y su agente de curado. Y vierta la mezcla no curada sobre la oblea maestra en un plato de Petri. El vacío trata la mezcla DE PDMS no curada hasta que no haya burbujas de aire presentes.
Luego cure durante la noche a 65 grados centígrados. Al día siguiente, usa un bisturí para cortar alrededor del exterior de la sección con patrón de la oblea. Y retire lentamente la losa de PDMS curada, colocándola en una tabla de corte limpia con el lado estampado hacia arriba.
Golpee los sellos individuales de la losa PDMS con un punzón de biopsia de ocho milímetros y coloque cada sello boca abajo en la cinta adhesiva para eliminar los desechos. Con estos sellos mirando hacia arriba, ceba cada sello con 100 microlitros de la solución CP pre-preparada, asegurando que no se formen burbujas de aire entre la solución y el sello. A continuación, invierta los sellos en una capa de solución CP y retírelos después de una hora.
Coloca cada sello húmedo boca abajo sobre un portaobjetos de vidrio limpio de seis a ocho veces para eliminar el exceso de líquido. A continuación, tratar al vacío los sellos durante uno a dos minutos. Adherir un espaciador de imágenes de ocho pozos y ocho milímetros de diámetro en la parte superior de una diapositiva de vidrio limpio como guía para la colocación de sellos.
Coloque un sello boca abajo en el portaobjetos de vidrio en el centro de cada pozo del espaciador de imágenes. A continuación, coloque un peso equilibrado de 5,6 gramos encima de cada sello y espere 10 minutos para el estampado. Retire los pesos y los sellos del portaobjetos y deje que la capa CP se seque a temperatura ambiente durante 24 horas antes de agregar biopartículas.
Si el CP está etiquetado con FITC, compruebe la eficacia del estampado con un microscopio fluorescente. Corte una losa PDMS en blanco al tamaño del espaciador de imágenes y utilice el punzón de biopsia de ocho milímetros para crear pozos en el PDMS que se alineen con los pozos del espaciador. A continuación, adhiera la losa PDMS a la corredera de vidrio.
Descongelar una solución de biopartículas y diluirla a 500 microgramos por mililitro en agua para inyección. Agregue 100 microlitros de solución de biopartículas a cada PDMS bien en el portaobjetos de vidrio y sacude el portaobjetos durante 30 minutos. Enjuague bien los pozos con agua y compruebe el patrón en la diapositiva con un microscopio fluorescente.
La micromatástica de la biopartícula se puede almacenar en un ambiente libre de polvo a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres meses. Preparar las células resuspendándolas a 7,5 veces 10 a las quintas células por mililitro en IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana. Añada 100 microlitros de la suspensión a un pozo PDMS que contenga la micromatástica de biopartículas, asegurándose de que la suspensión celular sea convexa sobre la parte superior del PDMS y no contenga burbujas.
Selle el pozo con un resbalón de cubierta de 12 milímetros de diámetro y presione suavemente hacia abajo con pinzas para que el exceso de suspensión celular se escape al borde del pozo, luego use un tejido para eliminar el exceso. Para crear imágenes de las células, cargue la matriz de micropartículas con células en la estación de imágenes de células vivas de un microscopio equipado con una incubadora de jaulas de 37 grados centígrados, un 5% de dióxido de carbono y un 90% de humedad relativa. Utilice microscopía de campo brillante, fluorescente y de lapso de tiempo para grabar imágenes con aumento de 10X cada 10 segundos a 405 nanómetros, 594 nanómetros y campo brillante.
Incubar los neutrófilos en los pozos con biopartículas a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono durante tres horas, tomando muestras en los puntos de tiempo deseados. Utilice un microscopio de campo brillante para verificar que los enjambres se forman en el microarray. Recoger todo el volumen de sobrenadante de un solo pozo, y cargarlo en un tubo de filtro de centrífuga de 0,45 micrómetros, asegurándose de analizar cada punto de tiempo en triplicado.
Centrifugar los tubos a 190 veces G y 20 grados Celsius durante cinco minutos, y recoger el volumen filtrado. A continuación, guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta el tiempo de procesamiento. Al intentar este protocolo, trabaje con fotorresistir y desarrollador en la campana de humos.
Tener un protocolo aprobado por el IRB antes de tomar sangre de donantes humanos. Recuerde que los materiales derivados de la sangre humana son BSL2. Cuando se añaden neutrófilos a la micromatástica de la biopartícula, los neutrófilos que contactan los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre.
La micromatrices de biopartículas fue validada utilizando microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear las migraciones de neutrófilos hacia los racimos de biopartículas. Enjambres de neutrófilos estables se forman alrededor de cada cúmulo después de 30 a 60 minutos de exposición. Por el contrario, los neutrófilos no muestran migración colectiva en ausencia de cúmulos de biopartículas.
La intensidad de fluorescencia de los núcleos de neutrófilos manchados se utilizó para determinar que el tamaño medio del enjambre alrededor de los racimos de biopartículas era de aproximadamente 1490 micrómetros al cuadrado. En ausencia de racimos, la fluorescencia de una región de interés determinada se mantuvo constante a lo largo del tiempo. Las pistas de migración de neutrófilos muestran que los neutrófilos convergieron en un grupo de biopartículas cuando uno estaba presente, pero no se observó convergencia en el sistema de control.
Se midió la velocidad de los neutrófilos enjambres y no inactivados, y se encontró una diferencia estadísticamente significativa en las distribuciones de velocidad. La velocidad media de los neutrófilos enjambres fue de 20,6 micrómetros por minuto, mientras que la velocidad media para los neutrófilos de control fue de dos micrómetros por minuto. Las concentraciones de 16 proteínas que los neutrófilos liberan durante el enjambre se analizaron con el tiempo.
10 proteínas aumentaron su concentración. Dos disminuyó. Y los cuatro restantes aumentaron durante la primera hora de enjambre, pero disminuyeron a partir de entonces.
Al realizar este procedimiento, asegúrese de que todo esté limpio y sus sellos se secan correctamente, ya que estos son esenciales para el patrón exitoso de las partículas bacterianas. El desarrollo de esta técnica permitirá a los investigadores explorar nuevas preguntas en el campo del enjambre de neutrófilos, incluyendo cómo los mediadores libres y las vesículas extracelulares participan en la comunicación intercelular de neutrófilos.
