Para empezar, transfecte las células del adenocarcinoma de estómago con TMEM200A Si-RNA e incube durante dos días. Luego, deseche el medio de cultivo celular de los pocillos y lave suavemente las células dos veces con un mililitro de PBS. Coloque las células en hielo y agregue 150 microlitros de tampón de lisis de ensayo de precipitación radioinmune preenfriado.
Con un raspador de celdas de plástico, separe con cuidado las celdas adheridas de la placa y transfiera la solución celular suavemente a un tubo de microcentrífuga preenfriado. A continuación, centrifugar el lisado celular a 1,5 por 10 elevado a la potencia de cuatro G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Con un kit de ensayo de proteína BCA, determine el contenido de proteína siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cargue 30 gramos de proteína de cada muestra en un gel SDS-PAGE al 10%. Haga funcionar el gel a 80 voltios durante 0,5 horas, seguido de 1,5 horas a 120 voltios. A continuación, transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF de 45 micrómetros a una corriente constante de 300 miliamperios durante 1 a 1,5 horas.
Coloque la membrana de PVDF en un agitador durante tres ciclos de cinco minutos cada uno. Después de agitar, agregue TBST al recipiente con el lado de la proteína hacia arriba. Coloque la membrana en el tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Lave la membrana con TBST durante tres ciclos de 10 minutos cada uno. Incubar la membrana con anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de lavar la membrana tres veces con TBST, agregue un anticuerpo secundario de conejo o ratón e incube durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, añada sustrato ECL a la membrana de PVDF durante 30 segundos y detecte la señal mediante un sistema de imágenes. La eficacia de TMEM200A se redujo significativamente en las células cancerosas gástricas HGC-27 transfectadas con Si-RNA, en comparación con las células no transfectadas. El TMEM200A Si-RNA inhibió significativamente las proteínas relacionadas en la transición mesenquimal epitelial y afectó la fosforilación de AKT en la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa.
