Para comenzar, ajuste los parámetros de la estación de pipetas colocada en la campana de flujo laminar a 1.900 voltios, 20 milisegundos en un solo pulso. Retire con cuidado un tubo de transfección del envase para mantenerlo estéril y llénelo con tres mililitros de tampón E. Para preparar las células para la electroporación, retire el medio de crecimiento de las células y lávelas con PBS para eliminar el suero y los cationes divalentes que promueven la adhesión.
Luego agregue una mezcla de PBS y un milimolar de EDTA a las células e incube a temperatura ambiente durante unos cinco minutos hasta que las células comiencen a desprenderse. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células y transferirlas a un tubo de 15 mililitros de baja unión a proteínas. Granular las células a 500 G durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, retire rápidamente la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro del sobrenadante en el tubo. Resuspenda las células en el sobrenadante restante y transfiéralo a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas. Retirar una pequeña alícuota de células para contar y granular las células restantes por centrifusión a 500 G a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Cuente las células durante la centrifugación. Tome 1x sgRNA en una solución de Cas9 de 20 milimolares y caliente los tubos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, retire todo el sobrenadante del gránulo celular y vuelva a suspender las células en PBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio a una concentración de 40 millones de células por mililitro.
Para el ensamblaje del complejo de ribonucleoproteína Cas9 de sgRNA, agregue 2,5 microlitros de sgRNA a un microlitro de Cas9 diluido en tubos de PCR esterilizados y dispense el sgRNA lentamente mezclando durante unos 15 segundos para evitar la precipitación. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo de ribonucleoproteínas. Para administrar el complejo de ribonucleoproteína por electroporación, prepare la punta de electroporación presionando el émbolo para extender el tallo.
Luego inserte el vástago en la punta. Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cargue la punta de electroporación con las celdas y retire la capacidad de volumen total de 10 microlitros de la punta.
Comenzando con el sgRNA de control negativo, transfiera 10 microlitros de células en la punta de electroporación al tubo de muestra que contiene 3,5 microlitros de ribonucleoproteína. Pipetea hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar bien y vuelve a colocar 10 microlitros de la mezcla en la punta. Coloque la punta en la estación de electroporación, bajándola al tampón y presione Inicio en la pantalla táctil.
Una vez completado, la pantalla indicará un pulso exitoso. Retire la pipeta del dispositivo y coloque las células en un pocillo seco de la placa de 12 pocillos sin recubrimiento. Enjuague la punta pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces en 15 mililitros de PBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio.
Deje a un lado la pipeta con la punta aún adherida. Agregue inmediatamente un mililitro del medio libre de antibióticos alícuota anterior a las células y agite suavemente la placa para mezclar. Aquí se muestra el cromatograma de secuenciación Sanger representativo del locus Rosa 26 de los macrófagos derivados de la médula ósea electroporados con una ribonucleoproteína Cas9 de sgRNA no dirigida controlada, sgRNA específico de Rosa 26 y genes Src y Cblb en los macrófagos editados.
El análisis de los genes diana mediante PCR y secuenciación de Sanger muestra múltiples nucleótidos en cada posición aguas abajo del sitio de escisión de Cas9. Estos resultados validan el logro de una alta eficiencia de edición para múltiples genes diana.
