Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Para comenzar, siembre la suspensión de células madre embrionarias humanas en una placa de pocillos P24 recubierta de Matrigel con 500 microlitros de medio. Incubar durante la noche para permitir la adhesión de las células. Al día siguiente, infecte las células adheridas a una multiplicidad de infección de 10, junto con ocho microgramos por mililitro de polibreno.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante ocho horas. Después de la incubación, reemplace el medio con medio fresco suplementado con estreptomicina penicilina, pero sin inhibidor de rocas. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, suplementar el medio con 0,8 microgramos por mililitro de puromicina para iniciar el proceso de selección.

Después de unos cuatro a seis días, divida las células estables en una proporción de uno a cuatro y expándalas para la criopreservación y el análisis posterior. Para realizar la selección de una sola célula, prepare una suspensión celular equivalente a 500 células en 10 mililitros de medio de crecimiento completo. Siembre 100 microlitros de esta suspensión en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

Deje las células intactas en una incubadora durante tres días, luego obsérvelas para ver si siguen creciendo. A continuación, marque los pocillos que contienen clones individuales. Cambie el medio cada dos días e incube hasta que las colonias alcancen el tamaño suficiente para una mayor expansión, criopreservación y análisis, lo que generalmente toma dos semanas.

Para empezar, obtener células madre embrionarias humanas diferenciadas hacia el destino del neuroectodermo. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, trátelas con 200 nanomoles de LDN193189 y 10 micromoles de SB431542 en medios de reemplazo de suero 100% knockout. Después de las 24 horas iniciales, incube las células con dos micromoles de XAV939 durante dos días más.

Después de tres días, reduzca gradualmente el porcentaje de medios de reemplazo de suero knockout durante un período de ocho días del 75 % al 50 %, luego al 25 % y, finalmente, al 100 % de medios N2. El día 12, fije las células para la tinción inmunológica utilizando Pax6 como marcador de neuroectodermo. Para los estudios de determinación del destino del mesodermo, trate el 70% de las células de confluencia con tres micromoles de CHIR 99021 en medios de endodermo definitivos durante 24 horas.

A continuación, se fijan las células para la inmunotinción utilizando braquiuria como marcador específico del mesodermo. Para estudiar la etapa endodérmica, agregue un medio endodérmico definitivo sin CHIR 99021 y cultive las células durante 24 horas adicionales. Para el ensayo de formación de cuerpos embrioides, siembre las células en superficies celulares de baja adhesión, omitiendo Matrigel para cultivarlas en condiciones de suspensión.

Las líneas celulares knockout A1, A5, B4 no mostraron cambios en el potencial de pluripotencia determinado por inmunotinción para los marcadores OCT4, NANOG y SOX2 en comparación con las células de control. La inmunotinción para el marcador de proliferación celular, KI67, no mostró cambios en la tasa de proliferación de las líneas celulares knockout en comparación con el control. La formación de colonias y cuerpos embrioides no se vio afectada en las líneas celulares knockout en comparación con el control.

Las líneas celulares knockout A1, A5, B4 conservaron la capacidad de diferenciarse en tres células de la capa germinal, como se confirmó mediante inmunotinción para los marcadores Pax6, braquiuri y FOXA2 sin cambios en el potencial de diferenciación en comparación con las células de control.