Para empezar, aísla la aurícula izquierda y las venas pulmonares del corazón del ratón. Coloque el tejido aislado en un criomold con la base del corazón y el ápice pulmonar hacia arriba. Desenrosque y desenrede los PV en caso de que estén enrevesados.
A continuación, llene el criomold con el compuesto OCT. Con pinzas finas, aplique una compresión suave sobre los PV sin moverlos para eliminar el aire residual. Congele el tejido en el compuesto OCT en hielo seco.
Para la inmunotinción, descongele los portaobjetos PV de ratón congelados en un sistema de tinción durante 20 minutos. A continuación, administre varias gotas de una solución fijadora de paraformaldehído al 4% en las secciones para asegurar el tejido al portaobjetos. Después de la incubación, mueva los portaobjetos a una rejilla vertical y sumérjalos en un recipiente lleno de PBS.
Coloque el recipiente en una coctelera lenta durante cinco minutos para enjuagar los portaobjetos. Con un bolígrafo bloqueador de líquidos que contenga xilol, rodea cada sección en cada portaobjetos. Y reorganice los portaobjetos en el sistema de tinción.
Con una pipeta Pasteur, aplique una o dos gotas de solución de permeabilización en cada muestra. A continuación, limpie la solución Triton X-100 lavando los portaobjetos durante cinco minutos en PBS. Después de reorganizar los portaobjetos en el sistema de tinción, agregue una o dos gotas del tampón de bloqueo a cada sección, asegurando una cobertura completa.
A continuación, prepare un mililitro de la mezcla de anticuerpos primarios que consiste en los anticuerpos primarios y el tampón de bloqueo. Deseche el búfer de bloqueo sobrante de la diapositiva. Administre dos o tres gotas de la mezcla primaria de anticuerpos en cada sección.
Después de la incubación, coloque los portaobjetos en una rejilla vertical y enjuague los portaobjetos durante cinco minutos en un tampón de lavado mientras mantiene una agitación suave. A continuación, prepare un mililitro de la mezcla de anticuerpos secundarios que consiste en los anticuerpos secundarios y el tampón de lavado. Vuelva a colocar los portaobjetos en el sistema de tinción y use una pipeta para dispensar dos o tres gotas de la mezcla de anticuerpos secundarios en cada sección.
Posteriormente, limpie los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno en tampón de lavado mientras agita. A continuación, agregue dos o tres gotas de la solución Hoechst 33342 a cada sección dispuesta en el sistema de tinción. Coloque los portaobjetos en una rejilla vertical y enjuáguelos durante cinco minutos en un tampón de lavado con agitación suave.
Agregue una o dos gotas de medio de montaje fluorescente a cada portaobjetos y selle los portaobjetos con cubreobjetos. La región del orificio de la vena pulmonar en la aurícula izquierda y la unión de la vena pulmonar, las venas extrapulmonares y las venas interpulmonares se observaron con un aumento de 10X. Se observaron señales específicas de cTnT con una estría muscular típica en el orificio de la vena pulmonar, las venas extrapulmonares y las venas intrapulmonares con un aumento de 40X.
Cx43 se encontró en las tres regiones pulmonares y se proyectó principalmente entre cardiomiocitos vecinos. Se observaron señales relacionadas con Cx43 en el lado polar y en el lado lateral de los cardiomiocitos en las mangas miocárdicas.
