Para comenzar, coloque engos de cubierta de vidrio de 25 milímetros en los pocillos de una placa de cultivo celular de seis pocillos. Coloque una gota de polilisina en el centro de cada cubreobjetos. Una vez completada la incubación, lave cada cubreobjetos tres veces con agua destilada.
A continuación, lave los cubreobjetos dos veces con una solución salina sin calcio. A continuación, instale las tapas en una cámara de grabación y llénela con solución salina sin calcio. Recoge las larvas errantes del tercer estadio del cruce genético deseado de drosophila.
Transfiera las larvas a un pozo de plato, luego lávelas tres veces con agua destilada. Coloque las larvas en otro recipiente de disección de vidrio que contenga 750 microlitros de solución salina helada y sin calcio. Ahora coloque una larva bajo un microscopio estereoscópico.
Con un par de fórceps, haz un corte transversal en la parte posterior del abdomen. Empuja la mandíbula con las pinzas para voltear las larvas del revés. Observe el cordón nervioso ventral junto a la mandíbula.
Retire con cuidado los discos imaginales y los tejidos cerebrales restantes. A continuación, separe el cordón nervioso ventral con el cerebro central y los lóbulos ópticos del resto del tejido. Transfiera el cordón nervioso ventral a la cámara de registro que contiene solución salina sin calcio.
Para evitar interferencias, fije los nervios restantes a la parte inferior del cubreobjetos con unas pinzas. Para realizar experimentos en cuerpos grasos, proceda a aislar los tejidos grasos de la larva resultante. Coloque los cuerpos de grasa aislados que expresan los sensores de trastes en la cámara de grabación.
Para adquirir imágenes de tejidos que expresan sensores, encienda el sistema de iluminación del microscopio. Coloque la cámara de registro que contiene los cordones nerviosos ventrales o los cuerpos grasos en la platina de un microscopio fluorescente. Para ver la fluorescencia GCaMP6f, ajuste la longitud de onda de excitación a 488 nanómetros.
Para metabolitos como sensores lacónicos, pirónicos, de ATP o de glucosa, ajuste la excitación a 440 nanómetros. Ahora configure la adquisición de imágenes a intervalos regulares para GCaMP6f y el sensor de metabolitos. Coloque el objetivo de inmersión en agua, asegurándose de que permanezca sumergido.
A continuación, conecte la cámara de registro a un sistema de perfusión. Utilice una bomba peristáltica de bajo flujo para extraer el líquido de la cámara y mantener un flujo constante de tres mililitros por minuto. Coloque la solución que contiene tubos a 25 centímetros por encima de la platina del microscopio.
Antes de cualquier estimulación, obtenga una línea de base de fluorescencia estable permitiendo que la solución de registro fluya durante cinco a 10 minutos. Ahora, reemplace la solución de flujo con la solución de estimulación que contiene glucosa, piruvato o lactato durante cinco minutos. Capturar las imágenes del cordón nervioso ventral estimulado que fue expuesto a 80 micromolares de picrotoxina para evaluar la actividad neuronal.
Los sensores lacónicos tanto en las células gliales como en las neuronas motoras responden a un lactato milimolar a una velocidad similar al inicio del pulso. Sin embargo, las neuronas motoras alcanzan un mayor aumento sobre la línea de base durante el pulso de cinco minutos. La señal del sensor de glucosa aumentó a un ritmo similar en las células gliales y las neuronas cuando se expusieron a cinco milimolares de glucosa.
Sin embargo, durante el pulso de glucosa, la señal en las neuronas aumenta más que en las células gliales. La eliminación del transportador Chaski redujo el transporte de lactato en las células gliales. Los aumentos de la actividad neuronal inducidos por picrotoxinas dieron lugar a una caída transitoria de los niveles de ATP en el soma de las neuronas motoras.
Se observó que el sensor lacónico se expresaba bien en los cuerpos grasos. Se observó un aumento de la fluorescencia de los sensores de glucosa cuando los cuerpos grasos se expusieron a un aumento de la concentración de glucosa. El aumento de las concentraciones de lactato y piruvato dio lugar a un aumento proporcional de la fluorescencia lacónica y pirónica.
