Para empezar, utilice una pipeta multicanal para pipetear 100 microlitros de cisteína de 10 milimolares en los pocillos de una placa de 96 pocillos en una campana estéril. Después de incubar la placa, aspire con cuidado la solución del pocillo y evite rayar el electrodo. Enjuague los pozos dos veces con agua desionizada estéril.
A continuación, agregue 100 microlitros de colágeno de cola de rata recién preparado, una solución en cada pocillo. Incubar bien la placa durante una hora con poca luz antes de lavarla dos veces con agua desionizada. A continuación, transfiera las células endoteliales cerebrales recolectadas a un comedero estéril fresco.
Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo, completando la siembra en 30 segundos, mantenga un medio de pocillo solo para fines de modelado matemático. En un adaptador de placa de 96 pocillos, mueva los clips rojos de cada lado hacia afuera para permitir que se inserte la placa. Con precisión, alinee el pocillo A de la placa con la región A uno del adaptador y aplique una presión suave sobre la placa para mantenerla firmemente en su lugar.
A continuación, vuelva a bloquear los clips rojos. Presione configurar para iniciar el instrumento después de cerrar la incubadora, todos los pocillos detectados correctamente se indicarán con un color verde en el mapa de placas. Presione el botón de verificación para autenticar las lecturas de impedancia absoluta.
Ahora use el menú desplegable debajo del mapa de placas para seleccionar el tipo de placa que se usa para el experimento. Seleccione multifrecuencia para medir la impedancia a varias frecuencias de corriente alterna. Finalmente, haga clic en el botón de inicio para comenzar el experimento.
Deje que las células proliferen hasta que se forme una monocapa de alta resistencia indicada por un aumento de ohmios. Asegúrese de que el crecimiento celular haya alcanzado una meseta antes de preparar las soluciones de tratamiento. Para preparar las soluciones de tratamiento, coloque los tubos de polipropileno de 1,1 mililitros etiquetados en placas de tubos de tira.
Agregue tres 50 microlitros de las citocinas o células de tratamiento en el tubo siguiendo un mapa de placas prefabricado. Luego colóquelos en la incubadora para calentarlos. En el software de las EIS.
Haga clic en pausa para detener temporalmente el experimento en curso. Cuando se le indique, abra la incubadora y suelte con cuidado ambos clips rojos mientras sostiene la placa firmemente. Con el experimento aún en estado de pausa, transfiera la placa a la campana estéril.
A continuación, retire los tubos extraídos del tratamiento de la incubadora. Con pipeta multicanal. Vuelva a suspender con cuidado el contenido de los tubos pelados del tratamiento.
Ahora pipetee 100 microlitros de tratamiento de los tubos extraídos y transfiéralo a los pocillos apropiados en la placa de 96 pocillos, agregue solo medios completos a los pocillos libres de celdas. Intente terminar el pipeteo en menos de cinco minutos, ya que un enfriamiento excesivo de la placa podría afectar la resistencia de la monocapa de células endoteliales. Vuelva a colocar la placa tratada en la máquina, luego verifique para evaluar la impedancia del pozo del electrodo.
Confirme que se han seleccionado los ajustes correctos de adquisición multifrecuencia y el catálogo de placas. A continuación, pulse reanudar para continuar con el experimento. Una vez que el experimento haya progresado hasta el punto final deseado, presione finalizar para guardar automáticamente el archivo grabado.
Navegue hasta el archivo y haga clic en exportar datos para exportar los datos como un archivo XLS o CSV para su posterior análisis. Se observó un aumento de la resistencia a lo largo de 30 horas, lo que indica la fase de crecimiento de las células endoteliales. Durante la fase de crecimiento, las células se estabilizaron en diferentes niveles a las 48 horas, la normalización de las mediciones permitió una interpretación más fiable de los cambios en la resistencia.
El recuento incorrecto de células endoteliales del cerebro antes del tratamiento dio lugar a una fase de crecimiento fluctuante, que disminuyó gradualmente hasta convertirse en una meseta de resistencia estable. La optimización de la densidad de siembra celular y el volumen de carga dieron como resultado una fase de crecimiento óptima. Las citocinas parecían tener un efecto transitorio sobre la barrera.
La adición de células de melanoma redujo drásticamente la resistencia de la barrera. La barrera paracelular y el componente basolateral fluctuaron con la adición de las citocinas, la adición de células de melanoma resultó en una mayor magnitud de disminución de la barrera paracelular en relación con el componente basolateral.
