Para comenzar, en la campana estéril, atornille las ollas de 24 pocillos del autoclave en el módulo de celda esterilizada con etanol. Agregue 900 microlitros de medio base en cada olla. Ahora conecte los electrodos de inmersión del autoclave magnéticamente a la tapa del módulo de celda.
A continuación, cierre la tapa sobre los pocillos para que los electrodos de inmersión encajen en los recipientes de electrodos inferiores. A continuación, conecte el módulo de celda al adaptador en una incubadora. A continuación, inicie el software y haga clic en la pestaña de diseño para cargar y anotar el mapa de placas experimental.
Utilice una placa de cultivo estéril de 24 pocillos para sujetar los insertos de membrana. Donde se requiera un recubrimiento, agregue una solución de matriz extracelular a la intersección del pocillo Con una pipeta de un solo canal, siembre cuidadosamente las células endoteliales del cerebro en la cámara apical de cada inserto de pocillo. Para crear un pocillo sin células, pipetee solo los medios completos en uno de los insertos.
A continuación, transfiera el módulo de células de la incubadora a una campana estéril. Con unas pinzas, transfiera con cuidado los insertos preparados a los recipientes de electrodos. Vuelva a colocar el módulo de celdas en la incubadora sobre el adaptador.
A continuación, localice la sección de espectro en la pestaña de control del experimento y seleccione Iniciar en un hercio y detenerse en 100 kilohercios para adquirir datos en todo el rango de frecuencias. A continuación, en el tiempo de espera, seleccione 15 minutos para permitir mediciones continuas a la velocidad más rápida. Presione iniciar para iniciar la recopilación de datos.
Después de aproximadamente 48 horas, una vez que se alcanza una meseta en la resistencia endotelial, coloque los tratamientos preparados en una incubadora para mantener una temperatura óptima. Retire el módulo de celda a una hora de tratamiento seleccionada que comience inmediatamente después de una medición de 15 minutos. En una campana estéril, abra el módulo de celdas.
A continuación, pipetee cuidadosamente 70 microlitros del tratamiento en la cámara apical del inserto correspondiente. Devuelva inmediatamente el módulo de celda al adaptador antes de que comience la siguiente medición. Para finalizar el experimento, presione el botón de detener, luego haga clic en archivo, seguido de exportar para exportar los datos directamente a un archivo XLS y asígnele el nombre apropiado.
Si bien se observó cierta variación entre los pocillos replicados, la normalización de los datos redujo esta variación y permitió una mejor comparación del tratamiento con el control. Se observó una disminución transitoria de la resistencia eléctrica transendotelial cuando se añadieron citocinas. Las líneas celulares de melanoma causaron una disminución sustancial de la resistencia en cinco horas.
