Para comenzar, agregue un mililitro de matriz extracelular al 1% a cada pocillo de una placa de seis pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Después de una hora, agregue dos mililitros de medio de mantenimiento precalentado que contenga 0.4 micromolares Y-27632 a cada pocillo.
Para descongelar las células madre embrionarias H9, agite el material criovial en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 segundos. Esterilice cuidadosamente el criovial con un spray de alcohol desinfectante al 75%. A continuación, transfiera las células descongeladas a un tubo de 15 mililitros que contenga el medio de mantenimiento y Y-27632.
Centrifugar el tubo a 190 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire con cuidado la mayor parte del sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio de mantenimiento que contenga Y-27632. Dispense 0,5 mililitros de la suspensión celular a cada pocillo de la placa recubierta de matriz extracelular que contiene el medio de mantenimiento.
Agite la placa lateralmente e incube la placa a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante al menos 24 horas. Cambia el medio todos los días. Una vez que la densidad de clones alcance el 70%, retire el medio gastado.
Después de los lavados 2D de PBS, incube las células con un mililitro de EDTA durante cuatro a siete minutos a temperatura ambiente y deseche el EDTA por completo. Agregue un mililitro de medio de mantenimiento a las celdas y golpee suavemente la placa. Luego transfiera las células desprendidas a un tubo de 15 mililitros y mézclelas de tres a cinco veces.
Agregue de 20 a 100 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de un plato recubierto de ECM previamente preparado y mezcle bien. Usando un microscopio, confirme la densidad celular e incube las células a 37 grados Celsius bajo un 5% de dióxido de carbono.
