Para comenzar, sumerja un frasco de HUVEC criopreservados en un baño de agua a 37 grados durante dos minutos. A continuación, enjuague el vial con etanol al 70% para evitar la contaminación. Pipetee cinco mililitros de ECGM precalentado en un tubo cónico de 15 mililitros.
Con una micropipeta, transfiera con cuidado las células descongeladas del vial al tubo cónico. A continuación, añada un mililitro de medio fresco precalentado al criovial para enjuagar el interior y transferir las células restantes al tubo cónico. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio fresco.
A continuación, transfiera las células a un matraz T75. Incubar el matraz en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados. Enjuague las células HUVEC confluentes al 90% en un matraz T75 con 10 mililitros de DPBS.
A continuación, añada un mililitro de 0,25%TE al matraz. Después de la incubación, golpee suavemente los lados del matraz y agregue cinco mililitros de solución neutralizante de tripsina. Luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros.
Recoja las células restantes con cinco mililitros de ECGM fresco y transfiéralas al tubo cónico. Ahora centrifuga el tubo cónico a 250 x g durante tres minutos para recoger el pellet de la célula. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de ECGM fresco y cuente las células.
Después de centrifugar de nuevo, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 90 microlitros de ECGM fresco. A continuación, succione brevemente los canales de los recipientes impresos en una placa para eliminar el lumen. Con una micropipeta, cargue suavemente el canal con 15 microlitros de la suspensión celular HUVEC.
Coloque la placa plana dentro de una incubadora durante dos horas. Posteriormente, invierta la placa a 180 grados, manteniéndola en posición plana durante las próximas dos horas. Después de cuatro horas, lave el canal con DPBS para eliminar las células no adherentes y muertas.
A continuación, pipetee dos mililitros de ECGM fresco en cada pocillo. Coloque el cultivo dinámico en un balancín con un ángulo de inclinación de 10 grados y cinco RPM. Las células HUVEC se adhirieron y proliferaron rápidamente para cubrir la superficie luminal de los canales vasculares de la VOP.
La maduración del endotelio se verificó mediante inmunotinción para CD31 5 días después de la siembra celular, lo que demostró la localización de CD31 en las uniones estrechas.
