Para empezar, obtenga embriones de pez cebra anestesiados en tampón E3. Después de seleccionar los embriones con la fluorescencia deseada, visualice los latidos de su corazón bajo un microscopio estereoscópico de campo claro. Con una pipeta de transferencia de punta ancha, extraiga hasta tres embriones y transfiéralos a una placa de imagen de vidrio inferior.
Bajo un microscopio estereoscópico, usando una pipeta, reemplace el medio alrededor de los embriones con una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 1%. Usando una punta delgada y cónica de plástico unida a una aguja de burla, empuje suavemente cada embrión hacia la parte inferior de la placa de imágenes y oriente el lado dorsal para mirar hacia el vidrio. Monta el embrión en un microscopio confocal invertido.
Después de configurar los parámetros de adquisición de lapso de tiempo, adquiera las imágenes. Abra el software de conversión de archivos Imaris y arrastre y suelte los archivos en el área de entrada. En el menú Salida, designe la ubicación de los archivos convertidos.
Haga clic en establecer el tamaño del vóxel para verificar y presione el botón Iniciar todo para iniciar la conversión del archivo al formato IMS. Una vez iniciado, deje que el software de análisis comience en la arena. Haga clic en Observar carpeta para abrir el archivo convertido anteriormente.
Una vez que el archivo esté cargado en el software, haga clic en la vista Slice para desplazarse por la pila z. Con el control deslizante de la barra de herramientas División en zonas, mida los diámetros de las celdas después de dibujar el diámetro de las celdas seleccionadas con el puntero. Haga clic y arrastre el ratón para dibujar segmentos que abarquen el núcleo de la celda y observe la longitud del segmento dibujado en la barra de herramientas de medición situada a la derecha del área de visualización.
Para detectar automáticamente las celdas, vuelva a la vista 3D y haga clic en el icono de punto en la barra de herramientas de objetos para agregar un nuevo objeto de manchas en la lista de objetos y abra el Asistente de creación automática de tintas planas. En el primer paso del asistente, tome la opción de segmentar solo una región de interés. A continuación, habilite la opción Rastrear puntos a lo largo del tiempo para calcular los datos de seguimiento, así como las Estadísticas de objeto-objeto para permitir la comparación entre puntos y ampliar el rango de datos.
Haga clic en el botón siguiente en la parte inferior derecha de la ventana del asistente. Especifique una región de interés, o área de ROI, que encierre el tectum óptico del embrión. Haga clic y arrastre las pequeñas flechas blancas presentes en cada cara del mismo para modificar el tamaño del ROI.
A continuación, extiéndalo a todos los fotogramas grabados con ajustes de intervalo de tiempo. A continuación, seleccione un canal de origen y establezca la medición del diámetro de la celda obtenida anteriormente como el diámetro XY estimado. Habilite la opción Resta de fondo y haga clic en Siguiente.
Introduzca los valores del umbral de intensidad directamente en las casillas de umbral inferior y superior para garantizar la detección de todas las celdas. Haga clic en Ver área para observar todos estos cambios en tiempo real. Una vez satisfecho, haga clic en Siguiente para validar el umbral de calidad seleccionado y haga clic en Ver área para visualizar los puntos que satisfacen estos dos parámetros superpuestos en el canal de origen.
A continuación, seleccione Movimiento autoagresivo como algoritmo de seguimiento para realizar un seguimiento de las celdas que tienen un movimiento más o menos continuo. Observe el movimiento de los puntos entre dos fotogramas para juzgar la distancia más larga que se mueve una celda entre dos puntos de tiempo e introduzca un número estimado en el campo de distancia máxima. Para establecer el tamaño máximo del espacio, si el intervalo entre fotogramas es inferior a 60 segundos, utilice un tamaño de tres y, para intervalos de tiempo más largos, aumente el mismo.
Habilite los huecos de relleno con todos los objetos detectados para eliminar el umbral de detección y conectar pistas. A continuación, haga clic en Siguiente y deje que el software genere automáticamente pistas para todos los puntos generados anteriormente. Si las pistas obtenidas son numerosas o fragmentadas, regrese al Asistente de creación con el botón Anterior y ajuste la distancia máxima definida anteriormente.
Para excluir las pistas de menos de tres a ocho minutos, introduzca el valor directamente en el campo de datos para el límite inferior del filtro de duración de la pista. Haga clic en Siguiente para validar el filtro y vaya al Asistente de creación. Elimine manualmente las huellas generadas por los macrófagos de la piel del análisis para centrarse en la microglía del parénquima cerebral.
Con el editor de pistas, corrija manualmente otros posibles errores en las pistas. A la derecha del área de visualización, active el botón circular Seleccionar modo y resalte las pistas que requieran modificaciones o ajustes. Una vez seleccionada la pista problemática, con los botones Conectar y Desconectar, edítela para representar correctamente los movimientos de la celda.
Con el Editor de pistas, seleccione el modo de selección de círculo para eliminar los puntos individuales duplicados. Si utiliza el indicador de microglía con otras células parenquimatosas marcadas con fluorescencia, ajuste el diámetro XY estimado y la distancia máxima a la nueva población de células. Modifique la entrada del canal de origen a la imagen.
Por último, mediante la pestaña Estadística, extraiga las estadísticas de seguimiento deseadas. Haga clic en el botón Configuración y seleccione las estadísticas para el cálculo de cada objeto puntual u objeto de superficie creado anteriormente. Se obtuvo una imagen del cerebro del pez cebra embrionario en su totalidad y se visualizó la ubicación de las neuronas con respecto a la microglía.
Los datos espaciales obtenidos mediante este protocolo muestran la velocidad media de las células microgliales, la distancia media que recorren en una hora, su desplazamiento cuadrático medio y su distribución en el espacio en diferentes momentos.
