Los autores desean agradecer a David Langenau por generosamente proporciona espacio de acuario; Eric Stone, John C. Moore y Qin Tang para ayudar a mantenimiento de pez cebra y reactivos y Anne Robertson y Elliott Hagedorn del laboratorio de Leonard Zon para procurar la variedad de pez cebra utilizada aquí. También le gustaría agradecer a Octavio Hurtado para asesoramiento sobre técnicas photolithographic. FE fue financiado por becas del Hospital de Shriner para los niños y la Asociación Americana de Australia. Este trabajo fue financiado por los NIH grant GM92804.

Microinyección de larvas fue aprobado por la Subcomisión de Hospital General de Massachusetts en investigación Animal cuidado bajo protocolo 2011N000127.
1. fabricación de dispositivo
Nota: Todos asistida por ordenador (CAD) archivos para diseñar máscaras de fotolitografía aquí descritos (figura 1) están disponibles para su descarga. Véase tabla de materiales para los enlaces.
<ol><li>Fabricación de la oblea del molde principal en una sala limpia de clase 1.000 utilizando técnicas photolithographic estándar7. De los canales y arreglos de discos de microestructura, patrón el photoresist negativo epoxy-basado secuencialmente en 3 capas con 3 máscaras separadas, según las instrucciones del fabricante: 100 μm para las características superficiales, 200 μm para las características de medio y 400 μm para las características profundas. Para el dispositivo de proyección de imagen, patrón de dos capas con 400 μm para las características superficiales y 600 μm para las características de profundidad.</li>
	<li>La oblea completa a la base de una placa de Petri para el bastidor (figura 2) de 15 cm de cinta.</li>
</ol>2. preparación de matrices superficie microestructuradas - PDMS
<ol><li>Para hacer que los dispositivos utilizables, la fundición de polidimetilsiloxano (PDMS), mediante la oblea del maestro como un molde. 50 g de monómero PDMS se combinan con 5 g de iniciador y homogeneizar en un plato de pesaje con un tenedor de plástico de plástico.</li>
	<li>Vierte cuidadosamente la mezcla sobre el molde.</li>
	<li>Degas en un desecador de vacío en 16-25 inHg (54-85 kPa) durante 1 hora.</li>
	<li>Para curar el PDMS, cuece al horno a 65 ° C durante al menos 3 horas. El PDMS debe curar a un sólido firme pero flexible.</li>
	<li>Corte con cuidado alrededor del dispositivo en la oblea del maestro con un bisturí, asegurándose de mantener contacto entre la punta del bisturí y la superficie de la oblea. Con unas pinzas, quite la réplica PDMS de la oblea y la transferencia a un limpio 10 cm plato de Petri, lado de la característica (figura 3).</li>
	<li>Tratar el dispositivo con plasma de oxígeno usando un horno de plasma de 35 s para reducir la hidrofobicidad.</li>
	<li>Cubrir con medio de embrión de pez cebra (E3) que contiene 168 mg/L de metanosulfonato de etilo 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). Quite las burbujas de las características más por las corrientes de agua sobre la superficie del dispositivo usando una pipeta de transferencia.</li>
</ol>3. preparación de matrices superficie microestructuradas - agarosa
<ol><li>Para hacer un molde negativo de PDMS, tratar en primer lugar un dispositivo PDMS con plasma de oxígeno.</li>
	<li>
Tratar el dispositivo PDMS con 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapor de silano para crear una superficie inerte8. Brevemente:
	<ol>
<li>Lugar el PDMS ser tratada característica hacia arriba en una cámara de vacío en una campana de humos.</li>
		<li>Al lado de los PDMS, coloque un pequeño recipiente de vidrio o aluminio abierto y cuidadosamente pipetee 200 μL de PFDTS (silano 98%) en el plato. PRECAUCIÓN: PFDTS silano es altamente volátil, reacciona violentamente con el agua, es inflamable y causa daño severo de la piel y los ojos al contacto. Leer MSDS en detalle antes de su uso.</li>
		<li>Cierre la cámara de vacío y aplique vacío durante 15-30 minutos, o hasta que el silano PFDTS se evapora completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el dispositivo en una caja Petri y utilizar como molde para PDMS fresco, preparado como se describe en el paso 2.1-2.3.</li>
	<li>Cueza al horno a 65 ° C durante al menos 3 h, luego pelar toda la capa de PDMS fresca desde el dispositivo de tratamiento y en un fresco plato de Petri. Esto puede entonces usarse como molde negativo a agarosa.</li>
	<li>Para preparar la agarosa, hervir una solución de 2% de baja agarosa temperatura gelificación en E3 en el microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente.</li>
	<li>Verter la agarosa caliente sobre el molde negativo de PDMS y eliminar las posibles burbujas en la agarosa cubriendo el dispositivo por agarosa caliente que fluye sobre las características con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Una vez que las burbujas se quitan, refrigerar a 4 ° C para establecer la agarosa.</li>
	<li>Desmoldar el bloque de agarosa negativo PDMS deformando el PDMS de debajo con la mano, transferir el bloque de agarosa a una nueva placa de Petri y mojado con E3 con MS-222.</li>
</ol>4. elaboración de PDMS dispositivos de imágenes
<ol><li>Para hacer que los dispositivos utilizables, la fundición de PDMS, uso de la oblea del maestro como un molde. 50 g de monómero PDMS se combinan con 5 g de iniciador (el mismo que utilizan en el paso 2.1) y mezclar cuidadosamente en un plástico plato de pesaje con un tenedor de plástico.</li>
	<li>Vierte cuidadosamente la mezcla sobre el molde.</li>
	<li>Degas en un desecador de vacío en 16-25 inHg (54-85 kPa) durante 1 hora.</li>
	<li>Para curar el PDMS, cuece al horno a 65 ° C durante al menos 3 horas. El PDMS debe curar a un sólido firme pero flexible.</li>
	<li>Cortar los dispositivos de la oblea del maestro y perfore puertos mediante un golpe de 1,5 mm.</li>
	<li>Tratar los dispositivos y un fondo de cristal 6-bien bien la placa con plasma de oxígeno para 35 s, como se describe en el paso 2.6.</li>
	<li>Enlazar un dispositivo característica hacia abajo a cada cubreobjetos de cristal de la placa de la pozo 6 colocando sobre una placa de 85 ° C durante 10 minutos. Nota: Para confirmar la vinculación exitosa, aplique una presión firme al lado del servidumbre dispositivo usando fórceps. El dispositivo debe permanecer pegado al vidrio cubreobjetos.</li>
</ol>5. pez cebra cultura
<ol><li>Embriones de pez cebra de cultura para 2 PD utilizando técnicas estándar3.</li>
	<li>Dechorionate embriones utilizando fórceps o 1 mg/mL de proteasa la mezcla (ver la tabla de materiales)3 por lo menos 30-60 minutos antes de cargar en el dispositivo, para que puedan enderezar.</li>
	<li>Anestesie embriones con solución stock (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5), añadir 1 mL de 25 X a la E3 en su placa de Petri.</li>
</ol>6. orientación del pez cebra en superficie microestructurada - arreglos de discos de hierba
<ol><li>Preparar el bloque PDMS de paso 2.7 (Figura 3A) en su placa de Petri que está cubierto por una capa delgada (1-2 mm) de E3, que permite la fácil manipulación de los embriones.</li>
	<li>Transferencia número de embriones (generalmente 10-20 por condición) sobre la superficie del bloque PDMS con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Utilizando una herramienta de micromanipulación (lazo del pelo o similar), introduzca los embriones de los divots microestructuradas (Figura 3A). Uso de chuletas es particularmente adecuada a las orientaciones de la dorsales y ventrales. Nota: Para las chuletas con un mayor ajuste (dorsal y ventral), trate de colocar los embriones en la superficie del bloque en paralelo a la hierba y luego los balanceo en posición usando un lazo del pelo. Empujándolos más profundos en la hierba ayudará a mantenerlos estables.</li>
</ol>7. orientación del pez cebra en superficie microestructurada - canales microestructurados
<ol><li>Extraer el bloque PDMS estampado con microestructurada canales (figura 3B) utilizando una pipeta de transferencia hasta el nivel de E3 cae por debajo del borde del bloque, pero aún está presente en el embalse y canales y en una capa delgada en el PDMS a E3.</li>
	<li>Transferencia 10 embriones de paso 5.3 en el depósito usando una pipeta de transferencia, teniendo cuidado de no desbordar los bordes.</li>
	<li>Usando un lazo del pelo, manipular cada embrión en el embudo a la entrada de la canal y orientar de tal manera que la cabeza del embrión es hacia el canal y el embrión tiene la orientación adecuada al entrar en el canal.</li>
	<li>Deslice cada embrión por el canal usando un lazo del pelo hasta llegar a la orientación microfeatures en las paredes del canal que ayudan a mantener en su lugar. Particularmente se recomienda el uso de canales microestructurados para la orientación lateral. Nota: Para reducir el deslizamiento durante la microinyección de embriones, trate de ajustar la cantidad de tensión superficial dibujando E3 del depósito.</li>
</ol>8. microinyección del pez cebra
<ol><li>
Preparar la aguja de la microinyección.
	<ol>
<li>Hacer el vidrio de borosilicate microcapillary agujas usando un extractor de micropipeta como se describió anteriormente4. Las agujas resultantes deben ser afiladas a un punto en un extremo, con una forma cónica longitud de aproximadamente 10 mm.</li>
		<li>Preparar la solución que se inyecta, en este caso 100 nM chemoattractant (N-formilmetionina-leucina-fenilalanina (fMLP) o leucotrieno B4 (LTB4)) y 100 nM de 70 kDa trazador de dextrano de rodamina en PBS.</li>
		<li>5 μl de solución de carga dentro de la aguja con una pipeta fina afilada punta (véase tabla de materiales).</li>
		<li>Monte la aguja en un micromanipulador montados en un soporte magnético y conectado a una microinyectora picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Romper la punta de la aguja a un ángulo de 45 ° por pellizcar la punta cónica con fórceps.</li>
	<li>Ajustar tamaño de bolo de inyección 1 nL ajustando el tiempo de inyección en el controlador picopump.</li>
	<li>Ajuste el ángulo de la aguja de la microinyección. Un ángulo de la aguja de 45 ° en el controlador de micromanipulación es generalmente un buen punto de partida, con la aguja paralela a la longitud del embrión. Un ángulo más escarpado puede utilizarse para minimizar el movimiento lateral del embrión durante la microinyección.</li>
	<li>Control de la placa de Petri con la mano izquierda y el micromanipulador de aguja con la derecha, llevar la aguja lo más cerca posible al sitio previsto de la microinyección, en este caso la vesícula ótica. Nota: La vesícula ótica puede ser identificada como el órgano oblongo posterior a la vista que contiene dos más pequeñas oscuras oblongas estructuras distintas (otolitos).</li>
	<li>Utilizar el controlador de micromanipulación, penetrar en el tejido objetivo (en este caso la vesícula ótica) tal que la punta de la aguja está dentro de la vesícula e inyectar el volumen preestablecido mediante el pedal de picopump. Nota: Si el tejido resiste la penetración, prueba golpeando suavemente la perilla del regulador de micromanipulación.</li>
	<li>Para liberar los embriones, flujo E3 sobre la superficie de arriba hacia abajo utilizando una pipeta de transferencia, o agitando el plato que los embriones se liberan en el E3 circundante.</li>
	<li>Transfiera los embriones a un plato de recuperación del E3 sin MS-222 con una pipeta de transferencia.</li>
</ol>9. cribado de embriones utilizando el dispositivo de la proyección de imagen de PDMS
<ol><li>Preparar el dispositivo de paso 4.7 flujo E3 (+ MS-222) a través del puerto. Esto puede hacerse utilizando una pipeta de 1000 μl o una pipeta de punta estrecha.</li>
	<li>Llenar el pozo con E3 + MS-222 hasta el aparato.</li>
	<li>Entregar 4 embriones inyectados de paso 8.7 en cada pocillo con una pipeta de transferencia. Embriones se puede previamente anestesiados si desean incubar en E3 + MS-222 1-2 min antes de la carga (paso 5.3).</li>
	<li>Utilizando una herramienta de micromanipulación (lazo del pelo o similar), acomode los embriones en las entradas de los canales de proyección de imagen en la orientación deseada (primero de cola o cefálico, dependiendo del dispositivo utilizado) y empujar parcialmente en el dispositivo (Figura 4A). Esto le ayudará a dibujar en el dispositivo de manera uniforme.</li>
	<li>Dibujar E3 a través del dispositivo desde el puerto con una pipeta o pipeta μL 1.000 hasta que los embriones son introducidos a los canales en la orientación correcta para la proyección de imagen (Figura 4B). Nota: Tenga cuidado de no aspirar los embriones más allá del punto de captura, esto dañará los embriones y cambiar su orientación.</li>
	<li>Transferir la placa de la pozo al microscopio para la proyección de imagen (figura 4).</li>
	<li>
Imagen con un microscopio fluorescente invertido.
	<ol>
<li>Ajustar magnificación seleccionando la lente adecuada. 10 X es generalmente un aumento útil para migración neutrófilo pez cebra la proyección de imagen.</li>
		<li>Ajuste intensidad fuente de luz y tiempo de exposición para cada canal de modo que cada señal es clara, pero no saturado.</li>
		<li>Captura de imágenes para cada canal. Aquí, se utilizaron proteína verde fluorescente (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), rojo de Texas (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) y canales de transmisión. Imágenes multicanales pueden combinarse durante el procesamiento posterior (Figura 4B-I).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Aquí, describimos el uso de los dispositivos recientemente desarrollado para facilitar 2 PD pez cebra microinyección5e introducir un dispositivo de montaje libre de agarosa simple imagen conveniente de embriones. Estas herramientas destacan la utilidad de técnicas photolithographic para la fabricación de dispositivos útiles para técnicas de pez cebra.
Hemos encontrado dispositivos MSA particularmente útil para la inyección de células o partículas tienden a la ...

Pez cebra se han convertido en un poderoso modelo para muchos campos, de los estudios de desarrollo biología fundamental a escala genética y química pantallas1,2. Rutina manipulaciones genéticas, como la sobreexpresión del gen, caída, CRISPR/Cas9 mutagénesis y transgénesis dependen de microinyección de material genético en el zigoto unicelular, que ha llevado al desarrollo de simple, fácil de usar, comercialmente herramientas disponibles para orientar y estabilizar huevos para inyección3. Otros enfoques, como el trasplante y la infección, a menudo requieren microinyección en la posterior etapa embriones y larvas con mayor calibre capilar agujas4. Sin embargo, el uso de agujas de calibre más grandes presenta importantes retos técnicos, ya que es más difícil penetrar el tejido sin empujar o rodando el embrión. En estas condiciones, obteniendo la tensión de agua apropiada requerida para estabilizar el embrión mientras que evitar durante el procedimiento de secado es difícil y embriones no sean idealmente orientado para la inyección en el tejido diana.
Tras la microinyección, es a menudo útil embriones inyectados para seleccionar aquellos que han sido inyectados con éxito y para capturar imágenes del momento inicial de la pantalla. Para enfrentar estos desafíos, hemos desarrollado una gama de dispositivos microestructuradas que ayudan a estabilizar 2 embriones de dpf en varias orientaciones para microinyección5y para después de la inyección rápida proyección basada en imágenes.
Para obtener suficiente resolución estructural en estos dispositivos, utilizamos técnicas photolithographic. Se utilizan en las industrias microelectrónicas y más recientemente extrapolarse para la fabricación de microfluidos, estos enfoques pueden alcanzar estructuras verticales que van desde 1-1.000 μm, con una escala adecuada para manipulación de larvas y embriones de pez cebra. Todos los dispositivos fueron fabricados con polidimetilsiloxano (PDMS), que es barato, robusto físicamente, biológicamente inerte y transparente.
Arreglos de superficie microestructuradas (MSAs) fueron el formato de bloques de PDMS con una superficie modelada, análogo a los canales simple en bloques de agarosa utilizadas para microinyección de huevos. Para la investigación después de la inyección, 6 dispositivos de imágenes puede ser vestida en una placa de 6 pozos con fondo de cristal estándar. Estos dispositivos están diseñados para facilitar la carga de los embriones, mientras que el procedimiento de descarga convenientemente permite rescate de embriones específicos, facilitando imágenes evaluación enfoques de una manera más fácil de utilizar que los dispositivos desarrollado previamente por el Beebe laboratorio6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Pez cebra han emergido como un poderoso modelo de varias enfermedades humanas y una herramienta útil para una gama cada vez mayor de estudios experimentales, que abarca la biología del desarrollo fundamental a través de las pantallas genéticas y químicas a gran escala. Sin embargo, muchos experimentos, especialmente los relacionados con infección y modelos de xenoinjerto, dependen de la microinyección y la proyección de imagen de los embriones y larvas, que son técnicas laboriosas que requieren habilidades y conocimientos. Para mejorar la precisión y el rendimiento de las técnicas de microinyección actuales, hemos desarrollado una serie de dispositivos microestructuradas para orientar y estabilizar embriones de pez cebra en 2 días post fertilización (dpf) en posición ventral, dorsal o lateral antes del procedimiento. Para ayudar en la proyección de imagen de los embriones, también hemos diseñado un dispositivo simple con los canales que Oriente 4 pez cebra lateralmente en paralelo contra un cubreobjetos de vidrio. Juntos, las herramientas que presentamos aquí demuestran la efectividad de enfoques photolithographic generar dispositivos útiles para la optimización de las técnicas de pez cebra.

El enfoque descrito aquí muestra el diseño (figura 1) y la fabricación de dispositivos para el uso con 2 pez cebra de la PD, utilizando técnicas de (figura 3) litografía suave y photolithographic (figura 2). Este método permite la prueba rápida de muchas iteraciones de diseño y las modificaciones y alteraciones y optimización de dimensiones microestructura para uso con el pez cebra en otras ...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K vistas.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Investigación

Bioingeniería

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biología del Desarrollo

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Análisis de la contracción cardíaca del pez cebra con interacción de realidad virtual

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Autor destacado: Imágenes de lámina de luz 4D de alta resolución y realidad virtual en pez cebra para el análisis de la función cardíaca en una sola célula

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

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Simples dispositivos de microfluidos para

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Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra