Para comenzar, lave la muestra fresca de aurícula humana en una placa de vidrio de 100 milímetros que contenga HBSS estéril. Agite suavemente las muestras en la placa para eliminar cualquier residuo de sangre. Transfiera la muestra a una placa de 100 milímetros humedecida con un pequeño volumen de HBSS.
Con bisturíes cruzados, corta la muestra en cubos de dos milímetros. A continuación, transfiera cuatro pequeños fragmentos miocárdicos a una placa de 35 milímetros. Coloque un cubreobjetos estéril sobre los fragmentos y aplique una presión suave.
Pipetee 1,5 mililitros de DMEM en la placa. A continuación, incubar las placas de cultivo a 37 grados centígrados, bajo un 5% de suplementación de dióxido de carbono. Cuando los cultivos hayan alcanzado el 85% de confluencia, retire la placa de la incubadora y use pinzas estériles para levantar el cubreobjetos.
A continuación, colócalo boca abajo sobre una nueva placa de 35 milímetros. Luego agregue PBS estéril para enjuagarlo. Ahora retire los fragmentos de miocardio.
A continuación, pipetee DMEM fuera de la placa. Use PBS estéril para enjuagar la placa que contiene las células crecidas. Después de desechar el enjuague, agregue un mililitro de EDTA al 0,25% de tripsina a cada placa e incube las placas a 37 grados centígrados, con 5% de dióxido de carbono, durante cinco minutos.
Después de la incubación, retire las placas de la incubadora y use un microscopio para confirmar el desprendimiento de células. A continuación, agregue dos mililitros de solución de parada de tripsina, o TSS, en cada placa para bloquear la tripsinización. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros.
Centrifugar a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante con una pipeta serológica de cinco mililitros. A continuación, añada tres mililitros de DMEM al pellet y vuelva a suspenderlo.
Coloque la suspensión de la celda en una placa de 60 milímetros. Incubar las células a 37 grados centígrados, bajo un 5% de suplementación de dióxido de carbono. A continuación, pipetee tres mililitros de solución estéril de gelatina al 0,2% en cada placa de 60 milímetros.
Después de la incubación, aspire la solución y agregue tres mililitros de PBS estéril hasta su uso posterior. Saque la placa que contiene los fibroblastos cardíacos de la incubadora. Retire el DMEM de la placa y enjuague con PBS estéril.
Después de desechar el enjuague, agregue un mililitro de EDTA al 0,25% de tripsina a cada plato. Utilice un microscopio para confirmar el desprendimiento de células. A continuación, agregue dos mililitros de TSS en cada placa para bloquear la tripsinización.
Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar el sobrenadante con una pipeta serológica de cinco mililitros.
A continuación, añada tres mililitros de DMEM al pellet y vuelva a suspenderlo. Retire el PBS de la placa recubierta de gelatina de 60 milímetros y coloque la suspensión celular en la placa. Cultive los fibroblastos en un estado de confluencia durante un máximo de 21 días.
Después de 21 días de cultivo, aspire el medio de cultivo. Luego enjuague las placas con tres mililitros de PBS. Después de aspirar el PBS y agregar un mililitro de solución de descelularización, observe la placa bajo un microscopio de contraste invertido.
Después de dos minutos, pipetear suavemente cuatro mililitros de PBS para diluir la solución de descelularización en las placas. Aspire la solución diluida. A continuación, enjuague suavemente las placas con PBS.
Por último, añade un mililitro de PBS a los platos. Guarde las placas recubiertas de matriz extracelular a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior. El crecimiento de los fibroblastos a partir de los pequeños fragmentos de miocardio nativo colocados en cultivo se observó en un plazo de tres a cinco días.
La descelularización dio lugar a un recubrimiento de matriz extracelular en la superficie de la placa. La composición y arquitectura de la matriz extracelular cardíaca producida in vitro se conservó debido a la descelularización.
