Este protocolo permite la producción de filamentos de matriz extracelular a granel a partir de líneas celulares cultivadas, lo que permite la investigación en interacciones de matriz celular, así como la investigación sobre el potencial de este biomaterial para la reparación de heridas. Estas fibras sintéticas pueden evitar la respuesta de cuerpo extraño dirigida contra los materiales sintéticos, sin dejar de extraer del rico repertorio de técnicas de fabricación textil para crear una amplia gama de implantes tejidos. Demostrando el procedimiento estará Cassandra Reed, una estudiante graduada de mi laboratorio.
Antes de sembrar las células, autoclave las membranas de fibra hueca a 121 grados Celsius durante 30 minutos, seguido de un tratamiento con 50 mililitros de fibronectina plasmática bovina en PBS a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono durante una hora. Al final de la incubación, utilice micro tijeras estériles para cortar las fibras a seis centímetros o menos, y utilice una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 21 para sembrar una vez 10 a las quintas células de fibroblastos directamente en la lumina de las membranas de fibra hueca. Coloque seis fibras de semilla en un plato Petri de seis pulgadas de diámetro, e incuba brevemente las fibras de semillas a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono.
Después de cinco minutos, transfiera las fibras de la incubadora a un nuevo plato de Petri de seis centímetros que contenga medio de cultivo de fibroblastos complementado con ácido L-ascórbico, ácido L-ascórbico 2 fosfato, y transformando el factor de crecimiento beta 1 durante hasta tres semanas en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, utilice fórceps o transfiera las fibras cultivadas a viales de centelleo individuales e incline cada vial para permitir la adición de hasta cinco mililitros de N-Metil-2-pirrolidona por el lado de los viales. A continuación, utilice una pipeta serológica para aspirar lentamente la N-metil-2-pirrolidona de cada fibra, y transfiera las fibras a nuevos viales de centelleo para una segunda inmersión en N-Metil-2-pirrolidona fresca.
Después de la tercera inmersión, enjuague los hilos de matriz extracelular resultantes tres veces en agua desionizada de una manera similar, y coloque una pieza de tres pulgadas de largo, una pulgada de ancho de 1/23 pulgadas de espesor de caucho de silicona con un molde rectangular central de ocho por cuatro milímetros en un portaobjetos de vidrio estándar de tres por uno. Después del autoclaving, poner cada fibra de matriz extracelular lado a lado en el molde de silicona de ocho por cuatro milímetros hasta que no haya espacio abierto visible. Coloque el molde en un tubo cónico de 50 mililitros y congele las fibras a 80 grados Celsius negativos hasta que estén completamente congeladas.
Para la descelularización, incubar el molde en 1%sulfato de dodecil sódico durante 24 horas a temperatura ambiente en un balancín con agitación suave. Al día siguiente, enjuague la matriz extractorular extracelular con tres lavados en tres mililitros de PBS por lavado, y llene el molde con Tampón de digestión de DNA/RNAs recién preparado durante una incubación de seis horas a cuatro grados centígrados. Al final de la digestión, aspirar la solución de digestión y enjuagar el moho tres veces en PBS estéril como se ha demostrado.
Después del tercer lavado, incubar los andamios en 10%Penicilina-Estreptomicina en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche antes de congelarse en un tubo cónico de 50 mililitros a 80 grados Celsius negativos durante aproximadamente una hora. Cuando la malla se haya congelado por completo, liofilice la malla extracelular descelular durante la noche, o hasta que esté completamente seca, y transfiera los andamios liofilizados a un recipiente estéril dentro de una capucha de biosecución y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta su uso. Aquí se muestra una sección transversal transversal de una membrana de fibra hueca de polisulfona fabricada con este protocolo, que exhibe capas externas e internas de poros similares a los dedos característicos de una membrana asimétrica.
Después de la siembra y el cultivo de células de fibroblastos, se producen enjuagamientos de N-metil-2-pirrolidona como se demuestra, se producen hilos translúcidos de matriz extracelular. Las células productoras de matriz extracelular siguen siendo viables dentro de las membranas de fibra hueca durante todo el período de cultivo de tres semanas. La matriz extraída tiene un aspecto translúcido cuando se hidrata, mostrando un color blanquecino y aspecto fibroso con una alineación longitudinal bruta sobre el ensamblaje de malla y la liofilización.
El paso más crítico es el proceso de disolución de las membranas de fibra hueca cultivadas en el disolvente N-metil-2-pirrolidona con el fin de extraer la matriz extracelular. El material producido por este método se puede utilizar para la fabricación de implantes de ingeniería de tejido para investigar la reparación de tejidos en estudios preclínicos. El N-Metil-2-pirrolidona utilizado en este protocolo es un irritante para la piel y los ojos, y por lo tanto se recomienda que maneje el producto químico utilizando guantes de nitrilo, gafas, una capa de laboratorio, y manejarlo dentro de una campana de humo.
