Después de recolectar lágrimas de ratón con fragmentos de tiras de Schirmer, coloque las tiras en un tubo de microcentrífuga de 600 microlitros que contenga 20 microlitros de agua estéril. Perfore la punta del tubo que contiene la muestra y transfiérala a un nuevo tubo esterilizado de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 2.000 g durante 20 minutos a 4 grados centígrados.
A continuación, extraiga las muestras para obtener un volumen total de aproximadamente 22 microlitros de sobrenadante por ratón. Coloque los tubos sobre hielo seco para evitar la degradación de la biomolécula. A continuación, agregue 200 microlitros de una solución monofásica de fenol y tiocianato de guanidinio homogeneizada por pipeteo, y deje reposar la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, añade 40 microlitros de cloroformo. Vórtice durante 15 segundos e incube la mezcla durante dos minutos a temperatura ambiente. Después de eso, centrifugar a 10.000 g durante 15 minutos a 4 grados centígrados.
Transfiera con cuidado la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 mililitros sin alterar la interfase. A continuación, agregue 0,5 microlitros de glucógeno a 100 microlitros de isopropanol y mezcle por pipeteo. Deje reposar la mezcla durante 10 minutos a menos 20 grados centígrados.
A continuación, centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Decanta rápidamente el sobrenadante. Agregue 200 microlitros de etanol frío al 75% y agite el tubo para resuspender la bolita de ARN.
Centrifugar a 8.000 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados. Después de retirar el etanol y secar el tubo durante 20 a 30 minutos, agregue 20 microlitros de agua libre de RNasa y vuelva a suspender el pellet. Luego, mida la densidad óptica en el espectrofotómetro de microvolumen a 260 y 280 nanómetros para evaluar la pureza del ARN.
Para sintetizar ADNc a partir de ARN de lágrima, agregue de 10 a 5.000 nanogramos de ARN. Mézclalo con un microlitro de oligo dT y hasta 12 microlitros de agua libre de RNasa. Girar a 500 g durante 30 segundos e incubar a 65 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, añada cuatro microlitros de tampón de reacción, un microlitro de inhibidor de RNasa, dos microlitros de mezcla de dNTP y un microlitro de transcriptasa inversa a la mezcla. Después de girar el tubo, incube a 42 grados centígrados durante 60 minutos. Después de eso, incube a 70 grados centígrados durante 10 minutos para concluir la reacción.
Utilice el programa y los cebadores que se muestran aquí para el ciclo de qPCR. Realice un análisis de la curva de leche para comprobar la presencia de dímeros de cebadores o amplicones inespecíficos en la reacción. La qPCR reveló valores de TC entre 20 y 24, un rango adecuado para la cantidad inicial de ARNm objetivo en la muestra.
Sin embargo, el análisis de la curva de fusión sugirió la baja presencia de ARNm objetivo. El gel de agarosa al 2% confirmó la presencia de amplicones en el tamaño esperado.
