Hemos mejorado el método RiboTag publicado anteriormente para reducir significativamente el fondo. Esto hace que la aplicación a modelos complejos como un sistema mutante sea más simple desde una perspectiva de análisis y mucho menos costosa. Aparte de la generación experimental de animales, el método RiboTag es considerablemente más fácil y más sencillo que otros métodos para analizar los mRNAs asociados ribosomas.
Al igual que todos los experimentos de ARN, las estrictas condiciones libres de RNase son fundamentales para el éxito. Si tiene experiencia limitada con ARN, compruebe sus condiciones realizando primero una extracción básica de ARN y luego siga adelante. Demostrando el procedimiento estará Lauren Chukrallah, una estudiante graduada de mi laboratorio.
Para preparar el tampón de homogeneización, añada 2,5 mililitros de un tris molar a pH 7,4, cinco mililitros de un cloruro de potasio molar, 600 microlitros de un cloruro de magnesio molar y 500 microlitros de MP40 a un tubo de 50 mililitros. Agregue agua tratada con pirocarbonato de dietil al tubo para llevar el volumen a 50 mililitros y mezcle hasta que se incorporen todos los componentes. Para preparar un tampón de lavado con alto contenido de sal, agregue 2,5 mililitros de una tris molares a pH 7,4, 15 mililitros de cloruro de potasio molar, 600 microlitros de un cloruro de magnesio molar y 500 microlitros de MP40 a un tubo de 50 mililitros.
Llémelo al volumen de 50 mililitros en agua tratada con pirocarbonato dietil y mezcle hasta que se incorporen todos los componentes. Prepesee todos los tubos de muestra, registre el peso y pre-enfríe en nitrógeno líquido. Mortero estéril pre-frío, pestillo y espátula de pesaje sobre hielo seco.
Luego, en hielo seco, utilice el mortero estéril preenfriado y el pestillo para romper las muestras de tejido congelado flash en trozos grandes y molerlo lentamente en un polvo fino. Usando la espátula preenfriada, raspe el polvo del mortero en un tubo de recolección preenfriado teniendo cuidado de mantener en hielo seco siempre que sea posible. Pesar el tubo con el polvo de tejido.
Calcular la masa del tejido restando el peso inicial del tubo del peso del tubo con la muestra en él. Registre este valor para el cálculo posterior de volúmenes de búfer de lelisis. Preparar el tampón de lisis añadiendo en 10 mililitros de ditiothreitol tampón de homogeneización, inhibidor de la RNase, cicloheximida, heparina y un comprimido inhibidor de la proteasa.
Mezclar hasta que todos los componentes se incorporen y mantener en hielo hasta su uso. Por cada 100 miligramos de muestra, agregue un mililitro de tampón de lelisis. Con la misma pipeta utilizada para añadir el búfer de lelisis, pipetee cuidadosamente el lysate resultante hacia arriba y hacia abajo para fragmentar las células y mezclar.
Continúe pipeteando durante generalmente de 25 a 30 golpes hasta que la muestra ya no sea viscosa. Ponga las muestras en hielo durante 10 minutos para que se licen. A continuación, gire las muestras en una centrífuga preenfriada a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a 10.000 g.
Un gran pellet flojo suelto se forma en la parte inferior del tubo. Tenga cuidado de no molestar el pellet, recoger el izado en un nuevo tubo y registrar el volumen de cada muestra. Para evitar la degradación de la muestra, asegúrese de que las muestras permanezcan frías durante todo el protocolo restante almacenando en hielo o a cuatro grados centígrados siempre que sea posible.
Ahora, calcular el volumen requerido de cuentas magnéticas acopladas a la proteína de unión de anticuerpos apropiada, proteína G.Para un mililitro de licato, utilice 375 microlitros de cuentas de proteína G para llegar a 30 miligramos por mililitro. Coloque la solución de perlas en un tubo de 1,7 mililitros en un bastidor de tubo magnético. Retire el disolvente de perlas y agregue un volumen igual de tampón de lysis fresca a las perlas.
En un rotador de tubo de sobremesa ajustado a 20 RPM a cuatro grados Celsius, gire el tubo cinco minutos para lavar. Coloque el tubo en el portatubos magnético y retire el tampón de lavado. Después de repetir el lavado dos veces más, agregue el tampón de lelisis en el volumen original para equilibrar las perlas.
Almacenar a cuatro grados centígrados o sobre hielo hasta su uso. Agregue 50 microlitros de las perlas equilibradas por cada mililitro de licato y gire a cuatro grados centígrados durante una hora. A continuación, coloque el tubo en el bastidor del imán y recoja el izado en un tubo fresco.
Deseche las cuentas usadas. Para el analia, agregue 25 microlitros de las cuentas equilibradas por cada mililitro y gire a cuatro grados centígrados durante una hora. Almacene las cuentas G de proteína equilibrada restantes en cuatro grados Centígrados durante la noche.
Por la mañana, coloque el tubo en el bastidor del imán y recoja el izado en un tubo fresco. Deseche las cuentas usadas. Desde ellicato despejado, conserve 50 microlitros como control de entrada de muestra.
Conservar a menos 80 grados centígrados. Por cada mililitro del lesato despejado, agregue cinco microgramos de anticuerpos anti-HA. Para evitar la pérdida de muestras, selle la tapa del tubo con película de laboratorio y gire las muestras de 16 a 18 horas a cuatro grados centígrados.
Por cada mililitro del lesato despejado, agregue 300 microlitros de cuentas de proteína G. Vuelva a sellar la tapa del tubo con película de laboratorio y gire durante dos horas a cuatro grados centígrados. Coloque el tubo de muestra en el bastidor del imán para permitir que las perlas se separen del izado IPed.
Pipetear el flujo a través de la lesate y desechar, conservando las perlas. Agregue 800 microlitros de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas. Coloque el tubo sobre un rotador durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Coloque el tubo de muestra en el bastidor del imán y deje que las perlas se separen del lavado. Retire y deseche el lavado. Agregue otros 800 microlitros de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas.
Cierre el tubo y deje que gire durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Coloque el tubo de muestra en el bastidor del imán y deje que las perlas se separen del lavado. Retire y deseche el lavado.
Repita el lavado una vez más. Después del lavado, añadir 3,5 microlitros de 14,2 molar beta-mercaptoetanol a las perlas y mezclar por vórtices durante 15 segundos. Extraiga el ARN utilizando un kit comercial de purificación de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Eluda la muestra en 30 microlitros de agua libre de RNase. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados. En este estudio, se aisló muy poco ARN de las muestras que carecía de Cre o Rpl22HA demostrando la eficacia de este protocolo para reducir el fondo IP y aislar los ARN genuinos etiquetados con ARN.
Se analizaron una serie de anticuerpos en los protocolos de aislamiento de ARN en muestras positivas de Cre y Rpl22HA. Estos resultados demuestran que la selección de reactivos puede tener un impacto significativo en la eficiencia de la P.I. Se examinó la eficacia del sistema RiboTag para aislar el ARN asociado al ribosoma.
Tanto para la entrada de tipo salvaje como para los genotipos IP, la concentración de entrada fue significativamente mayor que la concentración de IP, lo que indica que había más ARN en la muestra de entrada. En las agrupaciones totales de ARN, se esperaba que los valores del número de integridad del ARN estuvieran cerca de 10 con un RIN más alto correlacionado con una mayor integridad y calidad de la muestra inferida. Si bien las muestras IP tenían un RIN inferior a los de las entradas, los RÁN seguían dentro de un rango aceptable y no dependían del genotipo de la muestra.
Aparte de criar y mantener las condiciones libres de RNase, los investigadores deben asegurarse de que recogen y mantienen cada muestra sugerida. El ARN de entrada es especialmente clave para múltiples tipos de análisis posteriores. Para nuestro laboratorio, generalmente realizamos la secuenciación de ARN después de la inmunoprecipitación.
Esto nos permite consultar toda la cúpula de transcripción para la asociación ribosoma. Las alternativas incluirían el análisis de microarray o rt-PCR cuantitativo. Para nosotros, este sistema nos permite identificar cambios en los ARN asociados al ribosoma con la mutación de proteínas específicas de unión al ARN.
