Para empezar, prepare el búfer maestro. Fíltralo con un filtro de tamaño de poro de 0,22 micrómetros y almacena el tampón a 4 grados centígrados. A continuación, prepare 75 mililitros de tampón de extracción complementando el tampón maestro con tres comprimidos de inhibidores de la proteasa sin EDTA, 2 milimolares de ATP y 0,1 milimolares de DTT.
A continuación, añada 75 mililitros de tampón de extracción al gránulo de células bacterianas congeladas que expresan miosina VIIA, y deje el gránulo en el tampón de extracción con hielo hasta que se descongele. Después de eso, use una pipeta serológica para romper el pellet y acelerar el proceso de descongelación. Ahora sonique la resuspensión en hielo durante 10 minutos al 50% de amplitud usando una punta de media pulgada con 5 segundos encendidos y 5 segundos apagados.
Centrifugar el lisado total a 33.746 G durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Durante la centrifugación, lavar 3 mililitros de la suspensión al 50% de resina de afinidad anti-FLAG con 40 mililitros de PBS para preparar 1,5 mililitros de resina FLAG. Después, centrifuga la resina a 800 G durante 2 minutos a 4 grados centígrados.
Retire con cuidado el PBS sin alterar la resina. A continuación, añadir el sobrenadante de la centrifugación del lisado a la resina lavada e incubar con rotación continua a 4 grados centígrados durante 1 hora. Pellet la resina centrifugando a 800 G durante 2 minutos a 4 grados centígrados.
Y eliminar el sobrenadante sin alterar la resina. A continuación, vuelva a suspender la resina en 40 mililitros de tampón maestro y centrifugue a 800 G durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la resina.
Ahora transfiera la resina lavada a dos columnas de centrifugado de polipropileno. Lave cada columna una vez con 2 mililitros de tampón maestro. A continuación, centrifugar la columna a 1.400 g durante 2 minutos a 4 grados centígrados para eliminar el tampón maestro.
Para preparar un tampón de elución, añada 100 microgramos por mililitro de péptido FLAG al tampón maestro. Añade 300 microlitros de tampón de elución a la resina empaquetada en cada columna. Mezclar suavemente mediante pipeteo para asegurarse de que la resina esté completamente hidratada por el tampón de elución.
A continuación, centrifugar las columnas a 1.400 G durante 2 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera el flujo a un tubo de microcentrífuga limpio y manténgalo en hielo. Ahora, realice SDS-PAGE con las fracciones de elución para determinar sus concentraciones relativas.
Mientras el gel corre, prepare un tampón de diálisis con la composición dada. A continuación, combine las fracciones más concentradas. Transfiera la muestra a un casete de diálisis de corte de 10.000 pesos moleculares y dialice durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, descargue con cuidado la muestra del casete de diálisis. Alícuota 15 microlitros por tubo de PCR y coloque los tubos en un recipiente de nitrógeno líquido para la congelación instantánea. El complejo de miosina VIIA purificado fue confirmado por SDS-PAGE, mostrando una banda por encima del marcador de Dalton de 200 kilos, correspondiente a la cadena pesada de miosina VIIA, y tres bandas distintas entre los marcadores de Dalton de 22 y 14 kilos, que representan la calmodulina RLC y la proteína 4 similar a la calmodulina.
