Para comenzar, agregue un volumen de cámara de proteína de miosina-7a humana purificada en un tampón de motilidad de cloruro de sodio de 500 milimolares a la cámara de flujo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lave la cámara de flujo con tres volúmenes de cámara de un miligramo por mililitro BSA en tampón de motilidad de cloruro de sodio de 150 milimolares. Después de eso, extraiga el líquido usando una toallita limpia en la salida para absorber el exceso de líquido.
Luego, fluya un volumen de cámara de F-actina marcada con rodamina-faloidina de 10 nanomolares en un tampón de motilidad de cloruro de sodio de 150 milimolares a través de la cámara de flujo. Monitoree la unión de los filamentos de actina a la superficie bajo un microscopio fluorescente con un objetivo de 100x. Asegure una densidad óptima de filamento de actina para el seguimiento, con suficientes filamentos en el campo de visión pero lo suficientemente escasos como para evitar la superposición.
A continuación, lave la cámara de flujo con tres volúmenes de cámara de tampón de motilidad de cloruro de sodio de 150 milimolares para eliminar los filamentos de actina no unidos y el exceso de rodamina-faloidina. Para iniciar la motilidad, agregue un volumen de cámara del tampón final a la cámara de flujo. A continuación, grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una excitación de 561 nanómetros para visualizar la actina marcada con rodamina-faloidina.
Encuentre un área en el portaobjetos con la densidad de actina deseada y capture imágenes cada 30 segundos durante 30 minutos. A continuación, descargue e instale el programa Fast desde el repositorio de GitHub. Asegúrese de que sea la versión compatible con Python 3 con un módulo adicional para la conversión de archivos ND2.
Ejecute el programa Fast utilizando un valor de tolerancia de 33 para retener solo los filamentos que se mueven suavemente. A continuación, utilice el programa Fast para analizar las imágenes TIFF recién creadas. Establezca el valor máximo x en 20.000 nanómetros y el valor máximo y en 20 nanómetros por segundo para representar la longitud de filamento más larga y la velocidad máxima del filamento.
Luego, use px para establecer el tamaño de píxel de la imagen adquirida en 65 nanómetros. Establezca minV en 0,1 nanómetros por segundo como la velocidad mínima requerida para la inclusión del filamento en el análisis. Para establecer la distancia máxima permitida entre fotogramas para que se unan filamentos, utilice maxD, evitando la unión de filamentos separados entre fotogramas.
Utilice pt para establecer la tolerancia a las fluctuaciones en las velocidades de los filamentos, incluyendo solo aquellos filamentos con movimientos suaves. Por último, use d para indicar la carpeta que contiene las pilas TIFF para el análisis. El ensayo de deslizamiento del filamento de actina demostró la motilidad lenta de la miosina-7a, y la reproducción de video se aceleró 500 veces para visualizar el movimiento.
La distribución de la velocidad de la miosina-7a mostró un pico por debajo de los cinco nanómetros por segundo, lo que confirma su lenta motilidad.
