Para comenzar, coloque un tubo de 50 mililitros sobre hielo y agregue una solución de colágeno junto con otros componentes secuencialmente. Agite el tubo para mezclar bien. Con una pipeta P10, agregue una solución de hidróxido de sodio molar gota a gota mientras agita la solución de mezcla para ajustar el pH a 7,3.
Agregue 1,25 mililitros de matriz de membrana basal a la mezcla de colágeno de cinco mililitros y mezcle la solución suavemente. A continuación, coloque un plato de 12 pocillos en hielo durante dos minutos. Con puntas de diámetro ancho, agregue lentamente la mezcla de matriz de membrana basal de colágeno uno a la placa de 12 pocillos.
Coloque la placa de 12 pocillos en la incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas para solidificar la primera capa de hidrogel. Mantenga el colágeno restante de la mezcla de la matriz de una membrana basal en hielo para su uso posterior. A continuación, transfiera aproximadamente 60 agregados de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Y enfríe el tubo en hielo durante cinco minutos. Con una punta de pipeta P200, retire con cuidado el medio del tubo. Agregue 1,5 mililitros de la mezcla de membrana basal de colágeno uno, gota a gota, a los agregados celulares y mézclelos suavemente con una punta de pipeta P200 de diámetro ancho para resuspender.
Transfiera la placa con la primera capa de hidrogel de la incubadora a la cabina de bioseguridad. Agregue 1,5 mililitros de la suspensión de agregados sobre la capa de hidrogel curado y agite suavemente la placa para distribuir los agregados de manera uniforme. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante dos horas.
Precalentar el medio de diferenciación vascular dos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Agregue dos mililitros de medio a cada pocillo y cultive las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio cada tres días con un medio de diferenciación vascular fresco y precalentado dos.
Los organoides expresaron CD31, ERG1 y PDGFR beta, lo que indica la presencia de células endoteliales vasculares y parásitos. Las redes vasculares se visualizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo después del aclaramiento del tejido. Los organoides maduros teñidos el día 17 mostraron redes vasculares que encapsulaban los esferoides dentro del bloque de gel.
Los organoides recuperados el día 28 tenían redes vasculares que envolvían a los esferoides en lugar de expandirse radialmente.
