El siguiente protocolo proporciona instrucciones para generar células madre pluripotentes inducidas por el hombre autólogos a través de la reprogramación rápida y eficiente de fibroblastos dérmicos humanos aislados de una biopsia por punción cutánea. Los procedimientos pueden ser llevados a cabo por investigadores con poca o ninguna experiencia en la reprogramación celular y con el ajuste adecuado, permite el producto de células madre pluripotentes inducidas sin xeno-libre. Las células IPS autóloticas pueden utilizarse para aplicaciones de medicina regenerativa y para modelar enfermedades como trastornos genéticos o cáncer para investigar sobre los mecanismos moleculares subyacentes y desarrollar terapias más específicas.
La carga de trabajo es alta. Es extremadamente útil estudiar el protocolo antes de planificar cuidadosamente el experimento, incluyendo los pasos durante los cuales se deben preparar los reactivos y materiales. La demostración visual del procedimiento ayuda a las investigaciones con poca o ninguna experiencia a realizar el aislamiento celular y la reprogramación, evitando errores comunes relacionados con una posible contaminación microbiana y de ARN.
Bajo una capucha estéril, lave la muestra recién obtenida de la piel humana del abdomen en un plato de 100 milímetros con solución HPSS. Retira el cabello y la grasa usando fórceps finos y tijeras y disecciona con un bisturí para obtener fragmentos del tamaño de dos milímetros por uno milímetros, evitando cicatrices, sucias o quemadas áreas del tejido. Coloque cuatro fragmentos pequeños en cada plato de 35 milímetros, cubra con un vidrio de cubierta estéril y agregue 1,5 milímetros de I-DMEM.
Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante unos 15 días o hasta que las células alcancen el 85% de confluencia. Cambie el medio de cultivo cada tres días y compruebe el crecimiento de las células utilizando un microscopio de contraste de fase invertido diariamente. Ahora, levante los vasos de la cubierta con fórceps finos, colóquelos boca abajo en un plato de 100 milímetros y lave con 1X PBS estéril.
Retire los fragmentos de las muestras y deséchelos. Lávese las placas con 1X PBS estéril. Retire el 1X PBS y agregue tres milímetros de Trypsin-EDTA a las gafas de cubierta colocadas en el plato de 100 milímetros y agregue un milímetro de Trypsin-EDTA a los platos de 35 milímetros también.
Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Luego, bloquea la tripsinación añadiendo cinco milímetros de TSS a la placa de 100 milímetros y dos milímetros de TSS a cada plato de 35 milímetros. Recoger la suspensión en tubos estériles de 15 milímetros, centrífuga a 400 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 12 milímetros de I-DMEM. Divida la suspensión celular en alícuotas de tres milímetros y transfiera cada una a una placa de 60 milímetros. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Cambie el medio diariamente. Mantener las células en el cultivo hasta que alcancen una confluencia del 75%Después de eso, repita la tripsinación tres veces para obtener las células que pasan cuatro. Luego, sincronice las células reemplazando el I-DMEM por S-DMEM e incubar durante 48 horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Durante la sincronización celular, prepare el medio de expansión de fibroblastos y el cóctel de reprogramación total de ARN no modificado para la programación libre de fibroblastos. Para simplificar la preparación de los nueve tubos de alícuotas de ARN no modificadas que luego se dividen en 36, solíamos seguir un esquema que unimos a la pared de la campana. Recubrir una placa de 24 pozos transfiriendo 100 microlitros de matriz de membrana de sótano descongelados en hielo a cada pozo para cubrir uniformemente la parte inferior.
Incubar durante al menos una hora a 37 grados centígrados antes de sembrar las células. Aspirar el medio de placas con células en cultivo y lavar rápidamente en 1X PBS. Repita la tripsinación para obtener las células que se pasa cinco.
Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen adecuado de medio de expansión de fibroblastos. Preparar y limpiar el hemocicómetro con 70% de alcohol. A continuación, prepare una solución mezclando suavemente 10 microlitros de tríptica azul y 10 microlitros de suspensión celular en un tubo de 1,5 mililitros, e incubar durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.
Pipetear 10 microlitros de la solución en el hemocitometro y colocarlo en el escenario de un microscopio de contraste de fase invertido para contar. Las células no viables son azules, mientras que las células viables no están manchadas. Cuente las células en al menos dos cuadrados de la cámara del hemocicómetro.
Realizar una dilución para obtener una densidad de 2,5 veces 10 a las cuartas células por cada 500 microlitros de medio de expansión de fibroblastos y resuspender el pellet celular. Pipetear 500 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de la placa de 24 pozos. Incubar células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Por la mañana, retire el medio antiguo de cada pozo y sustitúyalo por 500 microlitros de medio de cultivo libre de factores pre-zarmed xeno-libre de factores. Incubar a 37% grados celsius por debajo del 5% de dióxido de carbono durante al menos seis horas. Descongelar cinco alícuotas de 15,4 microlitros del cóctel de reprogramación total de nmRNA a temperatura ambiente y colóquelas en hielo.
Añadir 234,6 microlitros de medio sérico reducido a cada alícuota, pipetear suavemente de tres a cinco veces y etiquetar cada uno como tubo A.Etiqueta cinco tubos estériles libres de RNase 0,5 mililitros como tubo B y mezclar seis microlitros de reactivo sintético de transfección de ARN que interfiere pequeño con 244 microlitros de medio sérico reducido. A continuación, utilice pipetas para añadir el contenido de cada tubo B a un tubo A gota sabia. Mezclar tocando la parte inferior del tubo.
Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de eso, para añadir 125 microlitros de solución compleja de transfección nmRNA de cada una de las cinco alícuotas a cada pozo, incline la placa y la pipeta caiga sabiamente en el medio. Mezcla el contenido en los 20 pozos balanceándote suavemente.
Utilice los cuatro pozos restantes como referencia. Incubar la placa durante 15 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, aspira el medio.
Bajo la capucha estéril, repita el procedimiento de transfección, como en el primer día, todos los días durante tres días más. En el día cinco, aspirar el medio e intercambiar con XF/FF Culture Medium fresco y precalentó bajo una capucha estéril. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Monitorear el cultivo celular diariamente mediante un microscopio de contraste de fase, hasta observar la formación de colonias IPSC. El objetivo de este protocolo era reprogramar fibroblastos dérmicos aislados de la piel abdominal utilizando un método de reprogramación no integrado. Los fibroblastos humanos se extraen de las muestras de piel abdominal dentro de una semana de cultivo y alcanzaron el 85% de confluencia en dos semanas.
Las células se caracterizaban por el crecimiento adhesivo en platos de cultivo plástico, y su morfología variaba de alargado y en forma de husillo a aplanado y en forma de estrella. La morfología de los fibroblastos y la disposición y el cultivo cambiaron drásticamente después de la siembra en BMM, cuando adquirieron una morfología alargada y se organizaron para formar estructuras ramificadas delgadas. Las pequeñas colonias ya eran visibles en la cultura en el primer día desde la primera transfección y su tamaño creció progresivamente con el tiempo, mientras que su número aumentó hasta el día siete y luego se mantuvo estable entre el día siete y el día 14, probablemente como resultado de colonias más pequeñas que se fusionan para formar colonias más grandes.
Dado que el procedimiento de reprogramación se llevó a cabo utilizando medios libres de antibióticos, en el caso de que no se garantizaran condiciones estériles, la contaminación microbiana se convirtió en un problema importante. La tasa de proliferación y la densidad de chapado afectan la eficiencia de la reprogramación, por lo que es importante planificar el passaging celular y definir la densidad de chapado sobre la base de la tasa de proliferación celular. Sustituyendo los reactivos derivados de animales por reactivos apropiados libres de xeno, este protocolo permite la reprogramación de fibroblastos humanos adultos en células IPS en un entorno de cultivo completo libre de xeno que no eran su uso clínico.
Las células humanas son una fuente potencial de infección con patógenos transmitidos por la sangre, por lo tanto, se debe usar equipo de protección personal durante todo el procedimiento.
