Esta revisión fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones, AI074420-02, Burroughs Premio al Investigador Wellcome, Hirschl Premios Científicos de Carrera de BKC y por el Centro NSF para Biofotónica Ciencia y Tecnología, Acuerdo de Cooperación PHY012099, y un Sistema de Salud de UCD Premio de Investigación de TH UCD CTSC CNRR ULRR024146.

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">ciencia Hübner et al 323:. 1743 hasta 1747 (2009)</a> . 1. Información general De célula a célula propagación del VIH fue descrito utilizando células infectadas por el VIH Jurkat como donantes de células CD4 y primaria de los linfocitos T como las células aceptor 1,2,3. En estos estudios, se detectó el virus en las células fijadas mediante la tinción de anticuerpos. Para realizar el seguimiento de la transferencia de virus de célula a célula en las células vivas, que explotan un clon recombinante, infecciosos molecular del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP 4. Lleva la proteína verde fluorescente (GFP) que se inserta en el interior de la proteína Gag entre los dominios de MA y CA. Este clon molecular del VIH mantiene infectividad, sin necesidad de virus ayudante. Las partículas de virus a partir de este clon se estequiométricamente cargado con la proteína fluorescente verde, que proporciona una señal fuerte de fluorescencia de supervisar montaje viral y la transferencia entre las células. Cuando se utiliza junto con un material inerte de células de seguimiento de los tintes fluorescentes, las células receptoras pueden ser discriminados a partir de células de donantes de entrada, y permitiendo a visualizar la Transmisión del VIH de una célula T infectada a una de las células T infectadas 5. La formación de sinapsis virológicas y la transferencia de virus a partir de una célula a otra puede ser observado en las células vivas, mientras que se cultivan en un sobre cerrado, permeables a los gases de cámara de imagen. (Día 1) 2. Preparación del VIH Gag-iGFP transfectadas las células Jurkat T <ol><li> Preparar el CD4 + T línea celular Jurkat (ATCC, Manassas, VA) con cuidado el mantenimiento de las células a una concentración entre 2 x x 10 5 y 8 10 5 células / ml en Jurkat medios de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina y 100 mg / mL). La clave del éxito: la cultura de las células Jurkat en concentraciones de más de 8 x 10 5 células / ml se traducirá en una reducción en la eficiencia de transfección. Nota: La transfección de VIH Gag-iGFP ADN proviral en las células T, como se describe a continuación, los resultados en la producción de un competente para la replicación del virus de inmunodeficiencia humana. Por lo tanto, todos los procedimientos deben ser realizados únicamente por personal calificado de laboratorio en función del nivel de bioseguridad 2 + o de bioseguridad de nivel 3 (BL2 + / BL3) salas de cultivo de tejidos. Trabajar con el VIH infeccioso en los centros de formación de imágenes deben ser aprobados por la oficina local institucional de bioseguridad. </li><li> Transfectar las Jurkats con el plásmido viral, VIH Gag-iGFP utilizando el método de nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 células por centrifugación durante 10 minutos a 150 x g. Aspirar el sobrenadante y lavar las células en solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS). Centrifugar las células y resuspender el precipitado a 97 l de pre-calentado, V nucleofector solución que contiene suplemento del fabricante. Agregue tres L de endotoxinas VIH Gag-iGFP plásmido (1 mg / l) a la suspensión celular y mezclar suavemente. La transferencia de la suspensión celular a una cubeta y nucleofect mediante el programa S-18. Inmediatamente la transferencia de las células a 3 ml de los medios de comunicación precalentado Jurkat cultura sin antibióticos. </li><li> Para preparar las células CD4 + objetivo de las sinapsis virológicas, se obtienen las células mononucleares de sangre periférica buffy abrigos mediante el uso de un estándar de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) de protocolo. Células T CD4 + son entonces seleccionados negativamente con un kit de aislamiento magnético de grano (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Estos pueden ser criogénicamente almacenaron en N2 líquido en alícuotas de 5 x 10 6 células/500 l de los medios de congelación (90% fetal bovino serum/10% DMSO). Descongelado CD4 + células T primarias son cultivadas en RPMI 10% FBS, suplementado con 10 unidades / ml de IL-2. </li></ol> (Día 2) 3. La recuperación de células vivas de Jurkats transfectadas con el VIH Gag-iGFP y tinción de las células diana con tintes fluorescentes <ol><li> Permitir que las células Jurkat a recuperarse de la noche a la mañana transfección. A continuación, retire los restos celulares por centrifugación en un material de Ficoll Hypaque gradiente de densidad. Prescindir de 1,5 ml de Ficoll-Paque de la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml. Suavemente superposición de este material con el gradiente de Jurkats transfectadas en un volumen de 5 ml de RPMI. Centrifugar las células a 400 xg durante 20 min a temperatura ambiente con el freno de apagado. Retire con cuidado las células de la interfaz de los medios de comunicación / Ficoll con una pipeta. Transferirlos a un nuevo tubo de 15 mL cónico. Diluir las células con RMPI a un volumen total de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Resuspender el sedimento en 3 ml de medio de cultivo Jurkat en 2 cm y (6 y placa) y el retorno de las células en el tejido incubadora de cultivo. </li><li> Para distinguir las células diana de las células del donante en experimentos de transferencia de célula a célula que prelabel las células CD4 + blanco con tintes fluorescentes. CD4 + en las células T primarias están etiquetados, incluso lación antes de su uso. Hemos tenido un excelente éxito de etiquetado células T con las dos CellTracker y tintes CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mientras que la concentración de colorante y los tiempos de incubación debe ser optimizado en función del medio de contraste y tipo de células empleadas, un protocolo de representante de los siguientes. Pellet 4 x 10 6 células CD4 + T cells principal girando a 400 xg durante 10 min. Se lavan las células con 5 ml de PBS y resuspender en 2 ml de PBS. Añadir CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 1,5 M y se incuba a 37 ° C durante 20 min. Añadir 8 ml de los medios de comunicación Jurkat completa y centrifugar a 400 xg durante 10 min. Resuspender las células en 3 ml de medio completo suplementado con 10 unidades / ml de IL-2 y el lugar en el cultivo de tejidos incubadora durante la noche. </li></ol> (Día 3) 4. Monitoreo de la célula a célula de Transmisión del VIH Gag-iGFP utilizando imágenes de células vivas Nosotros usamos el VIH iGFP Gag-las células Jurkat transfectadas 48 horas después de la transfección. Sin embargo, hemos utilizado con éxito células a las 24 horas, y tan tarde como 72 horas después de la transfección. <ol><li> Aproximadamente 48 horas después de la transfección, el VIH iGFP Gag-Jurkats expresa se ​​cuentan, se lava con CO 2-medios de comunicación independientes (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se resuspendió en células vivas imágenes de los medios de comunicación (CO 2 medios de comunicación independientes, el 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina y 100 mg / ml, 10 unidades / mL de IL-2) a una concentración de 3.1 x 10 7 células / ml. </li><li> De manera similar, lavar y volver a suspender la etiqueta principal CD4 + células T en una concentración de 1.3 x 10 7 células / ml en los medios de comunicación en vivo de células de imagen. </li><li> Mezclar el VIH Gag-iGFP transfectadas con CD4 Jurkats primaria + células T en una proporción de 1:2 o 1:3 y de carga en un cultivo de tejidos tratados, permeables al gas, microcámara (ibidi, Verona, WI). Por ejemplo, mezcla de 20 l de VIH iGFP Gag-Jurkats transfectadas con 40 l de la etiqueta principal CD4 + T cells. Carga de 50 l de esta mezcla en una cámara de ibidi y sellar la cámara con tapones. Asegurar los tapones, envolviendo el cable / interface ibidi cámara con parafilm. </li></ol> 5. Consideraciones para las plataformas de microscopía: spinning disco microscopía confocal Después de cargar una cámara de imágenes ibidi con las células, inmediatamente montar el dispositivo en un microscopio invertido óptico (Olympus IX71, Center Valley, PA). La cámara de ibidi deben ser transferidos al microscopio sólo por personal de laboratorio BL2 +-experto provisto de prendas de seguridad adecuadas. A pesar de células vivas, imágenes comúnmente utiliza cámaras de incubación cara a mantener la estabilidad del medio ambiente 37 º C, esto se logró mediante un calentador termostático sencilla y económica (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA), junto con una punta de tipo T termopar montado al lado de la muestra de retroalimentación temperatura adecuada. Hemos encontrado el uso de CO 2-medios de comunicación independientes que nos permite mantener la viabilidad celular alta, evitando el uso de una cámara de CO 2. Para amortiguar la plataforma contra las fluctuaciones de temperatura en la habitación y para bloquear la luz fondo de la sala, un gran velo negro se monta sobre el conjunto microscopio / calentador de configuración de la creación de una bolsa de aire con aislamiento de todo el sistema. Esto reduce en gran medida las variaciones de temperatura y asociados relacionados con la temperatura de la muestra la deriva, sino que requiere de pre-calentamiento durante 30 minutos antes de montar la muestra. 6. Adquisición de Datos, transferencia y procesamiento de imágenes Las imágenes se tomaron usando un aceite de 60x 1.42 NA objetivo de inmersión (UPlanApo N, Olympus), como la apertura numérica (NA) mejora notablemente la resolución. Para crear imágenes en 3D confocal, la exploración se realiza por una unidad de disco giratorio confocal (CSU-10, Yokagawa, Japón) que a la vez utiliza&gt; 800 puntos confocal para aumentar drásticamente la velocidad de barrido. Para complementar su velocidad, la CSU-10 se combina con una alta sensibilidad de electrones multiplicando acusado dispositivo de acoplamiento (EMCCD, ixon + 897, Tecnologías de Andor, Irlanda) para permitir que la cámara de imagen rápido, con poca luz que reduce tanto photobleaching y fototoxicidad. La fuente de luz de fluorescencia es un multi-longitud de onda ArKr iones de gas láser (Innova 70C, coherente, Santa Clara), donde la longitud de onda deseada (488 nm) y la potencia del láser mide justo antes de que el objetivo del microscopio (&lt;1 mW) son seleccionados por un acústico- óptica filtro sintonizable (AOTF), (Tecnologías de Andor). Para reducir aún más photobleaching y extender el tiempo de imagen total, el AOTF rápidamente (microsegundos) corta el rayo láser cada vez que la cámara está inactiva (10-20 ms), mientras que la imagen recién adquirida se entrega desde el CCD (15-30 ms de exposición) a la computadora. La luz del láser se acopla al sistema de disco giratorio con un cuádruple banda 405/488/568/647 espejo dicroico (Semrock, Rochester, NY). Emisión de fluorescencia se filtra utilizando un filtro de banda 525/50 (Semrock) dentro de una rueda de filtros (Ludl productos electrónicos, Hawthorne, NY) montado bntre la cámara EMCCD y la unidad de giro del disco confocal. Todo el hardware y la adquisición, incluyendo un z-etapa (Mad Laboratorios City, Madison, WI), están controlados por el iQ Andor v1.8 software. Para maximizar la velocidad de adquisición de alrededor de 1,2 a 1,9 segundos montones de imágenes en 3D, que los cultivos de la región de grabación de la cámara del EMCCD está abajo a la zona inmediata de la célula-pair. Por otra parte, a expensas de alguna información en z, z un gran paso entre 0,45-0,75 m se puede utilizar para acelerar la adquisición. Imagen bajo estas condiciones pueden durar hasta 6 horas - con continuos segmentos de un minuto 20-60 - con photobleaching mínimo. En total, cada segmento de datos por lo general ocupa 5.20 Gb de espacio, mientras decenas de miles de imágenes son tomadas. Para facilitar el transporte y el análisis de los grandes archivos de datos, cada conjunto de adquisición de las necesidades que se descompone y se exporta como un archivo TIFF Gb segmentos de la imagen utilizando el software v1.8 iQ Andor. A partir de aquí, muchos paquetes de software excelentes que están disponibles para el análisis de imagen, como Metamorph, Volocity y ImageJ (se recomienda su variación Fiji). Cuando los dos marcadores fluorescentes deben ser seguidos, que al mismo tiempo grabar tanto de ellos sin disminuir la velocidad de adquisición mediante el uso de un &quot;modo de pantalla dividida.&quot; Ambos marcadores son excitados por dos líneas diferentes ArKr láser a la vez (a menudo 488 nm y 568). Se inserta directamente delante de la cámara EMCCD es una imagen de separación (OptoSplit II, Cairn, Kent, Reino Unido) que separa las dos imágenes diferentes. Cada imagen es independiente filtrado con filtros de fluorescencia (Semrock) y proyectada de lado a lado de la cámara a la vez la creación de la &quot;pantalla dividida&quot; efecto. Esto requeriría entonces de cultivo manual y alineación de las imágenes más adelante en el procesamiento de imágenes. 7. Consideraciones para el procesamiento de imágenes y análisis de datos Por lo general el análisis de imágenes con Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) en ordenadores Macintosh (Apple, Inc). Girar imágenes de microscopía confocal láser de disco primero se ajusta en su intensidad para corregir photobleaching, entonces deconvolved con Volocity. Mediciones de la intensidad y el seguimiento de los puntos lagrimales Gag se realiza con el módulo de cuantificación Volocity. Para los conjuntos de imágenes en movimiento con respecto a una sinapsis pre-formado debe ser calculada, un algoritmo de rastreo automático que se utiliza el botón de pistas sináptica a lo largo de toda la secuencia. La inspección manual de las regiones de interés definidas por el software autotracking se deben realizar para confirmar que el software se ha seguido correctamente el objeto deseado. Para los objetos donde el contraste con los objetos que lo rodean es demasiado débil, el seguimiento manual puede llevarse a cabo en un fotograma a fotograma. El paquete de software Volocity permite la exportación de ubicación XYZ, el volumen y la señal integrada en los objetos deseados. La distancia de la sinapsis y la velocidad del objeto seguido se calculan mediante la normalización de los movimientos en el centro del botón sináptico. 8. Resultados representante Entre 10 y 15 minutos de la mezcla se debe ser capaz de visualizar el VIH iGFP Gag-que expresan las células Jurkat adherirse a células CD4 + en las células T primarias. Imágenes de estos conjugados, uno puede evaluar los movimientos de los puntos lagrimales Gag en las células infectadas, así como en las células diana después de synaspe. Se puede observar el movimiento de los puntos lagrimales Gag-iGFP en las células diana poco después de las sinapsis se forman.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Se describe aquí un método sencillo para visualizar la Transmisión del VIH de célula a célula. Una investigación reciente de nuestro laboratorio y otros sugieren que esto puede ser el modo predominante de propagación del VIH entre las células T. El método aquí descrito utiliza una forma recombinante del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP, que lleva una etiqueta codificada genéticamente la proteína fluorescente verde en el núcleo estructural de proteínas Gag,. Debido a los altos niveles de GFP se produce en cada partícula de virus, este clon competente para la replicación del VIH permite a los investigadores hacer un seguimiento de partículas individuales de virus en tiempo real. Este virus debe ser especialmente útil en los estudios relativos a la transferencia de montaje y de célula a célula del VIH. La transferencia del VIH de célula a célula de transferencia es muy eficiente. Durante tres horas de co-cultivo, se ve rutina virus trasladado a un 20-30% de las células T primarias evaluadas por citometría de flujo. Eficiencias similares son cualitativamente visto en imágenes de células vivas. Infectadas por virus las células T comienza la formación de las sinapsis con las células no infectadas principal T casi inmediatamente después de la iniciación del co-cultivo. Interesantes, no todas las principales células T son capaces de interactuar con las células Jurkat infectadas por el VIH a pesar de las interacciones forzadas con pinzas láser (observaciones no publicadas, GM). VIH Gag-iGFP sin duda será útil para determinar subconjuntos de células T que son más susceptibles a la transferencia de células de las células, tanto in vitro como in vivo.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

Mediante la fusión de la proteína verde fluorescente a las proteínas de su favorito, los biólogos tienen ahora la posibilidad de estudiar vivos complejos procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia de vídeo. Para seguir los movimientos de la inmunodeficiencia humana proteína central del virus en la célula a célula de transmisión del virus de inmunodeficiencia humana, tenemos buenas prácticas agrarias de etiquetado de la proteína Gag en el contexto de un clon infeccioso molecular del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP. Estudiamos este clon viral mediante microscopía confocal de vídeo. En el experimento visualizado siguiente, transfectar una línea humana de células T por el VIH Gag-iGFP, y usamos la etiqueta fluorescente CD4 + en las células no infectadas T como las células diana para el virus. Utilizando las diferentes etiquetas fluorescentes se pueden seguir fácilmente la producción viral y el transporte intercelular a través de estructuras llamadas sinapsis virológicas. Simples cámaras de gas permeable imágenes nos permiten observar con el microscopio de las sinapsis en vivo confocal de minutos a días. Estos métodos pueden ser utilizados para rastrear proteínas víricas a medida que avanzan en la de una célula a otra.

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.3K vistas.  Mount Sinai School of Medicine. Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Video: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...