VIH-1 uncoating estudios en el laboratorio Aiken fueron apoyados por las subvenciones del NIH AI40364, AI50423 y AI076121. Varios materiales clave, como los reactivos utilizados en el p24 ELISA, fueron proporcionados por la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de referencia de la División de SIDA, NIAID, NIH.

1. La producción de partículas de VIH-1 Antes de continuar, usted debe obtener el permiso y seguir las directrices de la oficina de Bioseguridad de la institución para trabajar en un centro de bioseguridad aprobada por el VIH infeccioso. Usted debe asegurarse de que el cuidado y las precauciones de seguridad son seguidos durante el trabajo en el laboratorio de bioseguridad. La producción de partículas de VIH-1 se realiza típicamente mediante transfección transitoria de células 293T con el VIH-1 proviral DNA utilizando un fosfato de calcio método de transfección 7, 8. Las reservas de virus de alto título crecido en la cultura de las células T infectadas son también adecuados. <ol><li> Cultura células 293T en Dulbecco modificado del medio Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (SFB) y complementado con antibióticos [penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 ug / ml)] a 37 ° C, 5% de CO 2 . </li><li> Separar las células de los platos casi confluentes con 0,25% de tripsina-EDTA y las semillas de 2x10 6 </sa&gt; células en 9 ml por cada 100 mm placa de cultivo de un día antes de la transfección. Semillas de seis platos de 100 mm de cultivo para la producción de viriones. Si la preparación del concentrado de los núcleos se requiere, más platos podría ser cabeza de serie para la transfección. </li><li> Al día siguiente, las monocapas de células debe ser alrededor del 25% confluentes y listo para la transfección. Por seis platos de las células a transfectar, trae 120 mg de material de ADN con un volumen de 2,7 ml con agua estéril. A esta mezcla se añaden 0,3 ml de 2,5 M CaCl 2 y 3 ml de 2XBBS, y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. Deje que la mezcla repose a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de la mezcla resultante gota a gota en el centro de cada plato mientras agita suavemente para mezclar. Coloque los platos durante la noche (~ 16 horas) en una incubadora a 35 ° C y 3% de CO 2. </li><li> Aspirar el medio de cultivo y cuidado añadir 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar PBS y añadir 5 ml de medio fresco. Cultivar las células en la incubadora a 37 ygrados; C y 5% de CO 2 durante 24-48 horas adicionales. </li><li> Recoger el sobrenadante de cultivo que contienen partículas virales, la transferencia a un tubo de 50 ml de centrífuga cónico. Combine los sobrenadantes de todos los platos y se centrifuga a 1.500 g durante 5 min para precipitar las células y los escombros. Se filtra el sobrenadante con 0.45 micras de tamaño de poro, filtros de jeringa. Se deben tomar precauciones para reducir al mínimo la formación de aerosoles al trabajar con el virus vivo. Esto incluye el uso de tubos cónicos con anillos o cubiertas cubo del rotor durante la etapa de centrifugación. Si esto no es posible, los tapones de rosca de los tubos deben ser envueltas con parafilm. </li></ol> 2. La concentración del VIH-1 viriones por ultracentrifugación <ol><li> Coloque el sobrenadante del cultivo (30 ml) en un tubo de centrífuga de 38,5 ml polyallomer (por Beckman rotor SW32Ti o equivalente). Suavemente subyacen en el sobrenadante que contiene virus con 5 ml de solución de sacarosa al 20% en PBS utilizando una pipeta de 5 ml. </li><li> Centrifugar durante 3 horas a32.000 rpm a 4 ° C (175.000 xg en r max) a las partículas de virus de pellets. </li><li> Aspirar el sobrenadante por aspiración, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento en el fondo del tubo. Añadir 0,5 ml de 1XSTE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) en el tubo y el lugar a 4 ° C durante 1 hora para aflojar el sedimento. El uso de un gran calibre una punta de la pipeta suavemente ml pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar el sedimento del fondo del tubo. A continuación, la transferencia de la suelta de pellets a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, teniendo cuidado de evitar la formación de espuma. Incubar a 4 ° C durante 1-3 horas a otro para permitir que el pequeños grupos de virus que se dispersaran. Durante este periodo, preparar el gradiente de sacarosa como se describe en el paso 3.1. </li><li> Pipeta suavemente la suspensión de virus de arriba a abajo varias veces y centrifugar a 8.000 rpm (6.000 xg) a 4 ° C en una microcentrífuga refrigerada durante 1 minuto para eliminar acumulaciones residuales. Mantener el frío de la muestra durante este proceso. </li></ol> 3. Gradiente de sacarosacentrifugación para aislar los núcleos VIH-1 en núcleos aislados mediante un &quot;spin-thru&quot; método 9 que es una modificación del método descrito anteriormente para la purificación del VIH-2 núcleos de 10. <ol><li> Prepare un 12 ml lineal del 30% al 70% de gradiente de sacarosa en tampón 1XSTE en un tubo de centrífuga de 14,5 ml polyallomer para SW32.1Ti rotor. Para preparar el gradiente, use un gradiente de 20 ml primero, el lugar de 6 ml de solución de sacarosa al 70% en el lado cercano (cerca del puerto de salida) y 6 ml de solución de sacarosa al 30% en el otro lado. Asegúrese de que las burbujas de aire no están atrapados en el canal que conecta las dos cámaras. Utilice el Auto Densi-Flow pendiente anterior a la bomba de la pendiente de la parte inferior de la parte superior del tubo que contiene 1 ml de solución de sacarosa al 85% en la parte inferior. Coloque con cuidado el gradiente a 4 ° C hasta que se enfríe (2-4 horas). </li><li> El uso de un gran calibre una punta de la pipeta ml suavemente el gradiente de superposición con 0,25 ml de solución de sacarosa al 15% en ECE contiene 1% de Triton X-100. </li&gt; <li> Suavemente superposición con 0,25 ml de solución de sacarosa al 7,5% en ECE con un gran calibre una punta de la pipeta ml. Tenga cuidado de no mezclar las capas. </li><li> Suavemente superposición con 0,5 ml de suspensión del virus a partir del paso 2.4. Este paso debe realizarse con cuidado para evitar cualquier alteración en el gradiente y la mezcla de las capas de sacarosa underlaid. </li><li> Colocar los tubos en el cubo de pre-enfriado SW32.1Ti y centrifugar a 32.000 rpm (187.000 xg en r max) durante la noche (16-20 horas) a 4 ° C. Para evitar hacer una pausa de la centrífuga, no comience hasta que el vacío de centrifugación en la centrífuga alcanza los 250 m </li><li> Recoger fracciones de 1 ml de arriba a abajo de la pendiente con el fraccionador gradiente de Auto-densidades de flujo. Coloque los tubos en hielo inmediatamente después de la recolección. Mezclar el contenido de los tubos por inversión varias veces, y retirar 50 l de cada fracción para la cuantificación por ELISA o ensayo de la actividad de la transcriptasa inversa. </li></ol> 4. La localización de los núcleos de VIH-1y el almacenamiento de núcleos <ol><li> Antes de realizar los ensayos de uncoating, es importante para determinar qué fracciones contienen intacto el VIH-1 núcleos. Esto puede ser determinado por p24 ELISA o ensayo de actividad de la transcriptasa inversa con el 50 alícuotas a partir del paso 3.6. </li><li> La recuperación de la CA asociada a los núcleos es a menudo relacionado con la estabilidad de los núcleos. Medir el núcleo asociado CA por p24 ELISA 9 con una muestra de cada fracción. Por otra parte, medir la actividad de la transcriptasa inversa de cada fracción. Utilizando ambos métodos, el pico debe estar alrededor de la fracción 10. </li><li> Piscina de las fracciones que contienen núcleos. Si los núcleos no se van a utilizar para el ensayo de uncoating inmediatamente, alícuota de los núcleos agrupados en 0,2 a 0,3 ml alícuotas, flash de congelación en N2 líquido y se almacena a -80 ° C. Núcleos congelados de esta manera son adecuadas para el ensayo de uncoating. El rendimiento de la CA de núcleo asociados es típicamente 1-2 mg por mililitro de p24 o alrededor del 15% del total del virión asociadasp24. </li></ol> 5. Ensayo de cinética del VIH-1 uncoating <ol><li> La cantidad de VIH-1 requiere núcleos por reacción uncoating es de aproximadamente 50 ng. Para realizar el ensayo in vitro uncoating, Prediluya la alícuota de los núcleos con un volumen igual de tampón 1XSTE frías para reducir la viscosidad de la suspensión y minimizar los errores de pipeteo. </li><li> Volver a diluir 100 l de los núcleos a 0,15 ml de solución tampón 1XSTE el resfriado que contienen 10 mg / ml de BSA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Nosotros complementamos el tampón STE con BSA (10 mg / ml) para minimizar la adsorción de CA a las paredes del tubo. Mix de veces la vuelta al tubo varias. No vórtice de las muestras. Incubar los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante intervalos de tiempo (15, 30, 60 y 120 minutos). Los tubos se deben sumergir en un baño de agua por lo menos hasta el nivel de la muestra interna con el fin de garantizar incluso el calentamiento. </li><li> Durante la incubación, mezcle suavemente el contenido del tubo de forma periódica (por lo general 5 -10 min) por el parpadeo del tubo. Para un control minuto cero, diluir 100 l de núcleos en 0,15 ml de solución tampón 1XSTE frío e incubar en hielo durante toda la duración del experimento (120 min). El control de minuto cero nos da el valor basal uncoating y se utiliza para determinar aumento de uncoating de los núcleos se incuba a 37 ° C durante diferentes intervalos de tiempo. </li><li> Al final del período de incubación, detener el proceso de uncoating colocando los tubos en hielo durante 10 minutos. </li><li> Centrifugar los tubos a 45.000 rpm (TLA-55 de rotor, 125.000 xga r max) durante 20 minutos a 4 ° C. Esto pellet los núcleos intactos y la libre circulación de CA liberados como resultado de uncoating de núcleos que permanecen en el sobrenadante. El rotor debe ser pre-enfriado a 4 ° C antes de cargar las muestras. </li><li> Transferir el sobrenadante a tubos de microcentrífuga nuevo preenfriado preferiblemente con carga de gel-tips almacenarse a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la pastilla no será visible a simple vista, a fin de tomar extremo cuidado wientras pipeteo con el sobrenadante. Volver a suspender las pastillas en 250 ml del diluyente de la muestra de ELISA (0,5% Triton X-100 y el 5% de los donantes de suero de ternera en PBS). Eficiente para asegurar la disolución de la pastilla, torbellino después de agregar el diluyente de la muestra de ELISA. Cuantificar el contenido de CA de la pastilla y el sobrenadante utilizando p24 ELISA como se describe en la siguiente sección. </li><li> El grado de uncoating se obtiene mediante el cálculo de la fracción de CA presentes en el sobrenadante. </li></ol> 6. Ensayo para CA por p24 ELISA <ol><li> Muchos kits comerciales de ELISA están disponibles y pueden ser utilizados para cuantificar CA. Uso comercial o de cualquier &quot;in-house&quot; ELISA e incluyen normas p24 para determinar la linealidad del ensayo. Diluciones de las muestras deben analizarse para asegurar la exactitud. </li><li> Hemos desarrollado un ELISA caseros que utilizan habitualmente para el ensayo de CA. El procedimiento es una adaptación del anterior informe 11 y se realiza con anticuerpos de captura y el detector dispone de la AID NIHS Programa de Investigación y reactivos de referencia. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Un ejemplo de un resultado de ELISA para la determinación de las fracciones que contienen núcleo se muestra en la Figura 1. Después de recoger las fracciones (1 ml cada uno), 50 l de muestra de cada fracción se utilizó para hacer diluciones seriadas y se analizaron por ELISA. El p24 total obtenido al sumar los valores de los doce fracciones fue de 14,5 mg. Como se muestra en las fracciones de la figura 8 a 10 núcleos de contenidos. El valor de p24 en las fracciones de núcleo que contiene 2,17 mg fue. El porcentaje de cursos asociados a p24 (14,97%) se determinó tomando la relación entre el valor de p24 en las fracciones de núcleo (2,17 mg) en el valor total de p24 (14,5 mg). Fracción de 1 o 2 siempre contendrá mayor cantidad de p24, lo que representa CA libre que no está asociado con los núcleos. Esto es seguido por una reducción gradual en los valores de p24 con cada fracción posterior, y luego un fuerte incremento y, finalmente, una fuerte caída de la p24valores. Si se cuida bien durante la carga de la pendiente entonces el pico de la central asociada a CA se encuentra alrededor de la fracción 10. Un resultado típico obtenido mediante el análisis de la cinética de uncoating del VIH-1 núcleos se muestra en la Figura 2. El gráfico muestra un incremento en función del tiempo en uncoating de tipo salvaje VIH-1 en los núcleos. El porcentaje uncoating valor se obtuvo mediante el cálculo de la fracción de CA presentes en el sobrenadante. Con la práctica, el ensayo es altamente reproducible y es útil para determinar la estabilidad de los núcleos viral in vitro. Tenga en cuenta que la reproducibilidad de la prueba depende en gran medida el manejo adecuado de las muestras durante el procedimiento. Puesto que los núcleos son inestables al calor, las muestras deben mantenerse a 4 ° C durante todo el ensayo, excepto durante el período de incubación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> Figura 1 densidad de equilibrio centrifugación en gradiente deVIH-1 en los núcleos. Una suspensión de virus concentrado se aplicó a la parte superior de un gradiente de sacarosa 30 a 70% lineal superpuesto con el 1% de Triton X-100. Después de la centrifugación a 187.000 xg durante la noche y 4 ° C, fracciones de 1 ml se obtuvieron de la parte superior (fracción 1) hacia abajo (Fracción 12) y p24 se cuantificó por ELISA. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> Figura 2 Evolución temporal del VIH-1 uncoating in vitro. Purificada del VIH-1 núcleos se diluyeron y se incuba a 37 ° C durante los intervalos de tiempo indicado. La muestra min cero se incubó en hielo durante toda la duración del experimento. Después de la incubación, las muestras fueron ultracentrifuga a 125.000 g durante 20 minutos a 4 ° C. Sobrenadante y los pellets se separaron y se analizaron por ELISA p24. El grado de uncoating se determinó como se describe en el texto del protocolo. Cada reacción uncoating se realizó por duplicado, las barras de error abarcan todo el rango de los dos valores.

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	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).</li><li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core.">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li><li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método descrito aquí para purificar el VIH-1 para estudiar los núcleos uncoating in vitro es útil para el estudio de esta fase del ciclo de vida del VIH-1, sobre todo debido a la falta de un método validado para analizar el VIH-1 uncoating en las células diana. Aunque este método utiliza el equilibrio ultracentrifugación para purificar los núcleos, otros han utilizado granulación directa después de la lisis breve con un 1% Triton X-100-12, 13 o granulación a través de un colchón de sacarosa r...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Nombre del reactivo </td><td width="197"> Empresa </td><td width="114"> Número de catálogo </td><td width="161"> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 031 CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25 a 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Composición: 50 mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl y 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajustar el pH a 6,95a temperatura ambiente. Filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Anticuerpo de recubrimiento: Anticuerpo monoclonal para p24 (183-H12-5C) </td><td> SIDA de los NIH Programa de Investigación y Referencia Reactivo </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primaria de anticuerpos de VIH-Ig (suero hiperinmune paciente humano) </td><td> NIH Investigación sobre el SIDA Programa de referencia y los reactivos </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo secundario: De cabra anti-IgG humana, conjugado con peroxidasa </td><td> Atravesar </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP sustrato </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB placas de 96 pocillos </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti SW32.1 y rotores de Ti y ultracentrífuga compatible </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 de rotor y ultracentrífuga de mesa </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alta velocidad de los tubos de microcentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi densidad de flujo gradiente fraccionador </td><td> Labconco Corp. </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradiente de ex </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

El genoma de los retrovirus está encerrado en una cápside rodeado por una envoltura lipídica. Para los lentivirus como el VIH-1, la cónica cápside está compuesta de proteína CA organizó como una red de hexágono. La cápside está cerrado por siete pentámeros en la punta gruesa y 5 en el extremo estrecho del cono 1, 2. Encerrado en esta cápside se encuentra el complejo ribonucleoproteína viral, y juntos constituyen el núcleo. Después de la fusión de la membrana viral con la membrana celular de destino, el VIH-1 es liberado en el citoplasma. La cápside se desmonta la liberación libre de CA en forma soluble 3 en un proceso conocido como uncoating. La localización intracelular y el momento del VIH-1 uncoating son poco conocidos. Solo sustituciones de aminoácidos en la CA que alteran la estabilidad de la cápside también afectar la capacidad del VIH-1 para infectar las células 4. Esto indica que la estabilidad de la cápside es fundamental para la infección VIH-1. </p&gt; VIH-1 uncoating ha sido difícil de estudiar debido a la falta de disponibilidad de ensayos sensibles y fiables para este proceso. Aquí se describe un método cuantitativo para el estudio de uncoating in vitro utilizando núcleos aislados de infecciosas del VIH-1 partículas. El enfoque incluye el aislamiento de los núcleos por la sedimentación de los viriones concentrada a través de una capa de detergente y en un gradiente lineal de sacarosa, en el frío. Para cuantificar uncoating, los núcleos aislados se incuban a 37 ° C durante varios intervalos de tiempo y, posteriormente, se sedimentaron por ultracentrifugación. El grado de uncoating se analiza mediante la cuantificación de la fracción de CA en el sobrenadante. Este enfoque ha sido empleado para analizar los efectos de las mutaciones virales de VIH-1 en la estabilidad de la cápside 4, 5, 6. También puede ser útil para estudiar el papel de los factores celulares del VIH-1 uncoating.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating es un paso esencial en la fase temprana del ciclo de vida del VIH-1 y se define como el desmontaje de la cápside y la liberación de los complejos de ribonucleoproteína viral (vRNP). En este sentido, demostrar las técnicas para el aislamiento de los núcleos intactos del VIH-1 viriones y cuantificar sus uncoating<em&gt; In vitro</em&gt;.

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K vistas.  Vanderbilt University School of Medicine. Uncoating es un paso esencial en la fase temprana del ciclo de vida del VIH-1 y se define como el desmontaje de la cápside y la liberación de los complejos de ribonucleoproteína viral (vRNP). En este sentido, demostrar las técnicas para el aislamiento de los núcleos intactos del VIH-1 viriones y cuantificar sus uncoating In vitro.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...