Los autores desean agradecer al Dr. Zhao y Gongpu Ke Danxia de apoyo técnico. Agradecemos a los Dres. Edward Egelman y Grigorieff Niko para compartir su software de procesamiento de imágenes. Reconocemos también el personal que apoya la Biología Estructural crio-ME instalaciones y cluster Beowulf y la red de la Universidad de la Escuela de Medicina de Pittsburgh. Este trabajo fue apoyado por GM082251 y GM085043.

1. Congelados-hidratados EM preparación de la muestra Dado que el VIH-1 proteína de la cápside (CA) 9 asambleas son estables sólo en sal (NaCl 1M) de amortiguación, lo que contribuye el ruido de fondo fuerte en la crio-ME imágenes, se utiliza una dilución rápida y la espalda del lado del método secante para reducir transitoriamente la sal concentración en la preparación de la red de congelados-hidratados EM. <ol><li> Descarga luminiscente del carbono lado de R2 de malla 200 / 1 mallas de cobre en Quantifoil 25mA durante 25 segundos. </li><li> Use un nebulizador para que la humedad en la cámara del medio ambiente, una de fabricación casera émbolo gravedad manual, al 80%. </li><li> En el FEI Vitrobot émbolo dewar, etano líquido frío con nitrógeno líquido. Monte el dewar caída del punto de congelación en el émbolo de la gravedad manual. </li><li> Aplicar 2,5 l de solución pre-ensamblados CA en el lado de carbono de la red, que se monta en unas pinzas, y la carga de las pinzas en el émbolo con el lado de carbono de la red de espaldas a usted. </li><li> Añadir 3 l de tampón de dilución baja de sal (NaCl 100 mM) a la parte de atrás de la parrilla e inmediatamente secar la parte de atrás de la parrilla con un trozo de papel de filtro. La superficie de toda la espalda de la parrilla debe estar en estrecho contacto con el papel de filtro durante aproximadamente 6 segundos, antes de retirar el papel de filtro. Inmediatamente caída de la red en etano líquido después de quitar el papel de filtro. </li><li> Quite las pinzas del émbolo y rápida transferencia de la red en una caja de almacenamiento de red. </li></ol> 2. Crio-microscopía electrónica de CA asambleas tubular <ol><li> La carga de la red congelados-hidratados en un operativo FEI Polara microscopio de electrones G2 en 200kV y equipado con una cámara Gatan 4Kx4K CCD. </li><li> En dosis bajas-el modo de búsqueda, con un aumento de ~ 200x y con una dosis &lt;0.001e - / A 2, pantalla de toda la parrilla de las zonas con hielo adecuado y guardar las posiciones de estas áreas en un fichero de escenario. </li><li> Recordar las posiciones de guarda y la pantalla más estas áreas con un aumento de 3.900 x en bajas dosis, el modo de búsqueda. Seleccione las áreas con una capa uniforme y delgada de hielo que contienen bien separados, largos tubos en los agujeros, para la recolección de datos. Guardar la ubicación de estas áreas en un archivo de la segunda etapa. </li><li> Cambiar a modo de exposición con un aumento de 59.000 x, la inserción de 100 micras de apertura el objetivo, y ajustar la estigmatización objetivo y la intensidad del haz de una dosis de ~ 15 e - / 2 por la exposición. </li><li> Volver al modo de baja dosis de búsqueda, pasar a una posición guardada e identificar y centro de un tubo de buen uso de la cámara CCD. Cambiar al modo de enfoque, ajuste el enfoque, y establecer un valor de desenfoque, m normalmente entre 0,5 a 2,5. Cambiar al modo de exposición, establezca un tiempo de exposición de 0.3 a 0.5 segundos, para una dosis de 15 e - / A 2, y recoger una imagen. Las imágenes se recogen en una cámara de placa, y las películas deben dejarse en reposo durante 10 segundos antes de que la foto está tomada. </li><li> Pasar a la siguiente posición guardada y repita el paso 5 para recoger más imágenes. </li><li> Las películas se desarrollan con toda su fuerza D19 durante 12 minutos y digitalizadas utilizando una Nikon Super Coolscan 9000 ED Escáner en un tamaño de píxel de 6.35 micras. El formato de archivos de imagen TIFF es. </li></ol> 3. Helicoidal de indexación Un objeto helicoidales pueden ser indexados por dos parámetros: el fin de Bessel, n, y el número de capa de línea, l. Cada línea de la capa en la transformada de Fourier, que se caracteriza por (n, l), corresponde a un conjunto de líneas en la red la superficie del objeto helicoidal denota por (h, k) los índices, usando la notación de una red en 2D. Para cualquier (h, k), una línea de capa (n hk, l hk) es una combinación lineal de dos vectores básicos (n = 10, L 10) y (n 01, l 01), que son los valores de n y l las dos principales líneas de capa (1, 0) y L (0, 1). se puede obtener a partir de la altura de la línea de capa medida a lo largo del eje Z en la transformada de Fourier. El valor de n se puede estimar mediante la siguiente ecuación 10 πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1) donde J n es la función de Bessel, que determina la intensidad de la línea n º capa, r es el radio del objeto helicoidal, y R es el radio de la amplitud máxima de la línea de la capa. El número de línea de capa, l, se relaciona con n por la regla de selección 11 l = tn + um ....................( 2) donde T y U son constantes de la hélice. Para cualquier hélice dada, puede haber unidades exactamente u exactamente (o muy cerca) t complete vueltas. <ol><li> Caja con un tubo relativamente recto y largo con un diámetro uniforme con el programa de EMAN 12 helixboxer y guardar la imagen en formato de MRC. </li><li> Determinar la distancia de repetición helicoidal, c, utilizando un programa basado en la correlación cruzada, tales como &quot;imgccf &#39;, en el paquete de MRC 13. </li><li> Calcular la transformada de Fourier con una longitud de caja nueva que es una parte integral de la distancia de repetición, c. </li><li> Elija dos líneas principales que definen la capa de dos vectores básicos de red de superficie (1,0) y (0,1). </li><li> Medir el radio del tubo, r, y la altura y el radio de las dos líneas principales en la capa transformada de Fourier, l 10, R 10, L 01 ​​R 01, respectivamente (Fig. 1). </li><li> Calcular n n 10 y 01 de acuerdo a la ecuación (1). </li><li> Dado que los valores n son sólo estimaciones, unas cuantas combinaciones de n 10 y 01 n se ponen a prueba en pasos posteriores (véase el paso 4.2) para encontrar el correcto uso de la simetría helicoidal IHRSR paquete de programas. </li><li> Calcular la simetría tornillo descrita por dos números reales: la rotación entre las subunidades (Δφ) y el aumento axial (Δz) de la hélice de una estrella (n = 1). Teniendo en cuenta l 10, l 01, n 10, y los valores de n 01, U y T se puede obtener mediante pruebas de un rango de valores m (por ejemplo, -50 &lt;m &lt;50) de acuerdo con la regla de selección. Por último, Δφ y Δz se calculan utilizando Δφ = 360 t / u, y Δz = c / u. </li></ol> 4. La reconstrucción tridimensional <ol><li> Segmentación de partículas <ol><li> Abrir una micrografía que contiene partículas de helicoidal, con el boxeador programa gráfico, que es un programa en el paquete de EMAN. </li><li> Corte helicoidal de la partícula en superposición de los segmentos. En el panel de control de Boxer, elegir el modo de hélice y establecer los parámetros para el boxeo: el tamaño de la caja debe ser más grande que el diámetro de la partícula y el valor de &quot;Olap&quot; debe ser aproximadamente el 90% del tamaño de la caja. </li><li> Después de hacer clic izquierdo en cada extremo de la partícula helicoidal, Boxer se generará automáticamente una serie de cuadros de partículas a lo largo de la longitud de la hélice. </li><li> Guardar los segmentos de caja, así como sus coordenadas. </li></ol></li><li> Inicial de la reconstrucción en 3D utilizando programas IHRSR <ol><li> Invertir el contraste de las imágenes de la crio-ME y aplicar filtros de paso bajo 14 (opcional) antes de su procesamiento con el verdadero método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio (IHRSR). </li><li> Abra la interfaz gráfica del programa de IHRSR escribiendo &quot;generador&quot;. Proporcionar la interfaz gráfica con toda la información de la pila de partículas en caja, incluyendo el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pantalla, los valores de los parámetros de simetría, etc Haga clic en el botón &quot;Finalizar&quot; para crear el guión de la reconstrucción, b25.spi. </li><li> Use un cilindro macizo o hueco, como una referencia inicial y permitir que el procedimiento para el ciclo hasta que no haya cambios en la simetría de tornillo definida, que ocurre generalmente después de algunos ciclos. El derecho de simetría helicoidal debe dar una forma estable de reconstrucción convergente. La reconstrucción generado en el último ciclo se utilizará como referencia inicial para un mayor refinamiento. IHRSR realiza la reconstrucción 3D utilizando programas de SPIDER. </li></ol></li><li> Reconstrucción con refinamiento iterativo 15 La reconstrucción 3D generada por IHRSR ahora se utiliza como referencia inicial para el refinamiento adicional. Durante el refinamiento, la simetría helicoidal se fija en Δφ y Δz, que se determinan a partir del procedimiento IHRSR. <ol><li> Determinar el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando programas CTFFIND3 y CTFTILT 16. </li><li> Multiplicar los segmentos de partículas por el uso de programas CTF SPIDER 17. La operación denominada FT en la sala de SPIDER se utiliza para calcular la transformada de Fourier (FFT) de la imagen 2D. A partir de entonces, la FFT se multiplica por los valores de CTF, determinado en los pasos anteriores, utilizando la operación denominada MU dentro del conjunto de SPIDER. El valor obtenido se transformó inversa hacia atrás para formar una nueva imagen (CTF-corregido) en el espacio real con la operación de SPIDER, FT de nuevo. </li><li> Realizará comparaciones de proyección mediante la comparación de las proyecciones de los volúmenes de referencia con la CTF-corregido imágenes usando multi-referencia de alineación. La variación en el ángulo de inclinación fuera del avión se limita a + / -10 ° y se tomaron muestras en pasos de 1 °. Introducir restricciones, como los coeficientes de correlación, en el plano ángulos cercanos a 0 º o 180 º, y limitada X turnos, para los parámetros de alineación de cada segmento. Incluir en la reconstrucción sólo aquellos segmentos que satisfacen las restricciones. </li><li> Después de cada ciclo iterativo refinamiento, una reconstrucción en 3D se genera mediante la proyección de vuelta y se divide por la suma sobre el CTF2. </li><li> Imponer la simetría helicoidal para generar un volumen simetrizada. El refinamiento iterativo se termina cuando no hay mejora en la resolución de la nueva reconstrucción en 3D se produce. </li><li> El procesamiento de imágenes SPIDER paquete se utiliza para la mayoría de los pasos de refinamiento. Una serie de operaciones son controladas por los scripts de araña, que son creados por el usuario los archivos de control de proceso por lotes que contienen secuencias de las operaciones y valores de los parámetros. La reconstrucción final se calcula utilizando los programas de SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos: Un solo de VIH-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) estaba en caja y su transformada de Fourier (fig. 1b) se calculó para la indexación helicoidal. Para las líneas de la capa (1, 0) y (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Teniendo en cuenta un radio de tubo de 211.57Å, nos aproxima n 10 =- 12, n 01 = 11 (en este caso, la imparcialidad estaba predeterminado). Con una distancia de repetición de 5195.48Å, la simetría del tornillo del tubo se determinó como Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz y Δφ se perfeccionaron a 7.1321Å y 328,86 ° utilizando IHRSR (Fig. 2a) y la reconstrucción inicial se muestra en la figura. 2b. La reconstrucción final (Fig. 3), después de refinamiento iterativo, la mejora del mapa de densidad de manera significativa a partir del modelo inicial calculada con IHRSR (Fig. 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Indexación del VIH-1 CA tubo helicoidal. (A) Un solo por VIH-1 CA de tubo de imagen A92E. Barra de escala, 30 nm. (B) La transformada de Fourier de la sonda se muestra en (A). Los índices helicoidal (n = 10 =- 12, n = 01 11) se indican. Los puntos de punta de flecha a la línea de capa a una resolución de 23 bis. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una reconstrucción inicial con IHRSR. (A) Tornillo de la determinación de la simetría de cada ciclo iterativo. Δφ y Δz, a partir de los valores iniciales, coinciden en los valores estables después de 10 ciclos iterativos refinamiento. (B) El primer mapa 3D de la densidad después de 10 ciclos iterativos. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. El mapa de densidad de 3D después de que el refinamiento iterativo. (AC) El mapa de densidad de los tubos de CA se muestra como tres rebanadas ortogonal: paralelo al eje del tubo y cerca de la superficie (A), perpendicular al eje del tubo (B), y en paralelo ya través del eje del tubo (C) . Las barras de escala, 10 nm. (D) la representación de la superficie de la mapa de densidad de contornos 3D en 1.8s adjuntando volumen de 100%.

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No hay conflictos de interés declarado.

Se presenta un conjunto de protocolos para proporcionar un método directo para obtener las estructuras 3D de los objetos helicoidales. Utilizando los procedimientos descritos, hemos adquirido una estructura 3D del VIH-1 de la Asamblea cápside de un único tubo de imagen (176 segmentos). Estructuras superiores de resolución se puede lograr mediante la inclusión de más datos de la imagen. Hay varios puntos críticos para la recolección de datos óptimo y análisis: En primer lugar, durante la preparación de una muestra de la crio-ME, la solución de la muestra debe ser borrado, dejando una capa uniforme y delgada de solución que es ligeramente más grueso que el tamaño de la muestra. Hay varias maneras de secar la muestra. De las células bacterianas y las muestras tubulares, como el VIH-1 de la Asamblea CA, borrando de un solo lado, sobre todo de la parte posterior del lado, es el más apropiado. En segundo lugar, la imparcialidad de la hélice debe ser determinado, ya que esto no se puede hacer mediante la indexación de hélice o de reconstrucción. Una práctica común es usar hielo-grabado, seguido por el Rotary sombra 18 para determinar la lateralidad. Imparcialidad también se puede determinar después de la reconstrucción cuando la resolución del mapa de densidad es suficientemente alta, los modelos 3D atómica de los componentes individuales deben encajar muy bien en el mapa de densidad cuando se supone correcta imparcialidad. De lo contrario, la imparcialidad contrario se debe asumir. En tercer lugar, un filtro de Wiener se debe utilizar durante el procesamiento de imágenes, tanto la fase de corrección y amplitud, para reducir la amplificación de ruido. Dado que la CTF a partir de una sola imagen siempre tiene cruces por cero, parte de la información en el espacio recíproco se ha perdido. Por lo tanto, es necesario disponer de datos de múltiples conjuntos de proyección incluido para la reconstrucción 3D, imágenes en cada uno de los valores de desenfoque diferentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Fuente </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Glow-100X dispositivo de descarga </td><td> Glow-100X dispositivo de descarga </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscopio con una pistola de campo de emisión </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K CCD de la cámara </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Sumérgete de congelación dispositivo </td><td></td><td> De fabricación casera manual de émbolo gravedad </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mallas de carbono holely-rejillas de cobre </td><td> Quantifoil Micro Herramientas, Jena, Alemania </td><td></td></tr><tr><td> EM software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programas disponibles de Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM software Araña </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC basado en software de procesamiento de hélice </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programas disponibles de Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT y el espacio real de software refinamiento helicoidal </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

Crio-microscopía electrónica (crio-ME), en combinación con el procesamiento de imágenes, es una herramienta cada vez más potentes para la determinación estructural de complejos de proteínas macromoleculares y asambleas. De hecho, la microscopía electrónica de partículas solo una y dos dimensiones (2D) cristalografía de electrones se han convertido en dos metodologías relativamente de rutina y un gran número de estructuras se han solucionado con estos métodos. Al mismo tiempo, procesamiento de imágenes y de tres dimensiones (3D) la reconstrucción de los objetos helicoidales se ha desarrollado rápidamente, sobre todo, el proceso iterativo helicoidal real espacio de reconstrucción (IHRSR) Método 3, que utiliza solo las herramientas de análisis de partículas en conjunción con simetría helicoidal. Muchas entidades de función biológica en formas filamentosas o helicoidal, como los filamentos de actina 4, 5 microtúbulos, las fibras amiloides 6, virus del mosaico del tabaco 7, 8 y flagelos bacterias, y, debido a un mapa de densidad 3D de una entidad helicoidal se puede lograr a partir de una sola proyección la imagen, en comparación con la gran cantidad de imágenes necesarios para la reconstrucción 3D de un objeto no helicoidal, con el método IHRSR, el análisis estructural de tales asambleas helicoidal flexible y desordenada es ahora una meta alcanzable. En este artículo de vídeo, que proporciona protocolos detallados para la obtención de un mapa de densidad 3D de un conjunto de proteínas helicoidales (VIH-1 cápside 9 es nuestro ejemplo), incluyendo protocolos para la preparación de muestras crio-ME, dosis bajas de recolección de datos de la crio-ME, la indexación de los patrones de difracción helicoidal, y procesamiento de imágenes y reconstrucción 3D utilizando IHRSR. En comparación con otras técnicas, la crio-ME ofrece la conservación óptima de muestras en condiciones casi nativo. Las muestras se insertan en una capa delgada de hielo vítreo, mediante la congelación rápida, y la imagen en los microscopios electrónicos en la temperatura del nitrógeno líquido, bajo condiciones de baja dosis para minimizar el daño por radiación. Las imágenes de muestra se obtienen en condiciones casi nativo a expensas de la señal de baja y de bajo contraste en las micrografías registrado. Afortunadamente, el proceso de reconstrucción helicoidal ha sido en gran parte automatizado, con la excepción de la indexación del patrón de difracción helicoidal. Aquí se describe un enfoque de índice de estructura helicoidal y determinar simetrías helicoidal (parámetros helicoidales) a partir de microfotografías digitales, un paso esencial para la reconstrucción 3D helicoidal. En pocas palabras, se obtiene un primer mapa 3D de la densidad por el método de IHRSR. Este mapa inicial se iterativamente refinados mediante la introducción de restricciones para los parámetros de alineación de cada segmento, por lo tanto el control de sus grados de libertad. Nuevas mejoras se consigue mediante la corrección de la función de transferencia de contraste (CTF) de la microscopía electrónica (corrección de la amplitud y fase) y mediante la optimización de la simetría helicoidal de la asamblea.

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Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Este artículo describe un método para obtener una imagen tridimensional (3D), estructura de las moléculas helicoidales ensamblados con crio-microscopía electrónica. En este protocolo, el uso de conjuntos de la cápside del VIH-1 para ilustrar el procedimiento detallado de reconstrucción 3D para el logro de un mapa de densidad por el método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio real.

Estructura del VIH-1 Asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K vistas.  University of Pittsburgh School of Medicine. Este artículo describe un método para obtener una imagen tridimensional (3D), estructura de las moléculas helicoidales ensamblados con crio-microscopía electrónica. En este protocolo, el uso de conjuntos de la cápside del VIH-1 para ilustrar el procedimiento detallado de reconstrucción 3D para el logro de un mapa de densidad por el método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio real.

Video: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Asistida por microondas diagnóstico rápido de enfermedades de virus de plantas por microscopía electrónica de transmisión

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...