Esta revisão foi apoiado pelo National Institutes of concede Saúde, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, prémios de carreira Hirschl Scientist para BKC e pelo Centro de NSF para Biophotonics Ciência e Tecnologia, Acordo de Cooperação PHY012099, e uma Saúde UCD Prêmio de Pesquisa do Sistema para TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Ciência 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Visão global Célula a célula-propagação do HIV foi originalmente descrita utilizando células Jurkat infectadas pelo HIV como células do doador e CD4 + primárias linfócitos T como células aceitador 1,2,3. Nestes estudos, o vírus foi detectado em células fixas usando coloração de anticorpos. Para acompanhar a transferência do vírus de célula a célula em células vivas, nós explorar um recombinante, clone infeccioso molecular do HIV chamado HIV Gag-iGFP 4. Ele carrega a proteína verde fluorescente (GFP) inserida internamente na proteína da mordaça entre os domínios MA e CA. Este clone molecular do HIV mantém infectividade sem a necessidade de vírus auxiliares. Partículas do vírus a partir desta clone são estequiometricamente carregado com proteína fluorescente verde, proporcionando um forte sinal de fluorescência para monitorar a montagem viral e transferência entre as células. Quando usado em conjunto com inertes de células-tracking corantes fluorescentes, pilhas destinatário pode ser discriminado a partir de células de doadores de entrada, e permitindo que se visualize a transferência de HIV de uma célula T infectada para uma célula T não infectados 5. Formação de sinapses virológica e transferência de vírus de uma célula para outra pode ser observada em células vivas, enquanto eles são cultivadas em um selado, câmara de imagem gás-permeáveis. (Dia 1) 2. Preparação de HIV Gag iGFP-Transfectados Células T Jurkat <ol><li> Prepare o CD4 humano + das células T linha Jurkat (ATCC, Manassas, VA) cuidado com a manutenção das células em uma concentração entre 2 x x 10 5 e 8 10 5 células / mL em Jurkat meios de cultura (RPMI 1640, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / mL de penicilina, estreptomicina e 100 mg / mL). Chave para o sucesso: Cultura de células Jurkat em concentrações acima de 8 x 10 5 células / mL irá resultar em uma redução na eficiência de transfecção. Nota: A transfecção de DNA HIV Gag iGFP-proviral em células T, como descrito abaixo, resulta na produção de uma replicação competente vírus da imunodeficiência humana. Como tal, todos os procedimentos que devem ser realizadas apenas por pessoal treinado em laboratório certificado nível de biossegurança 2 + ou salas de cultura de biossegurança nível 3 (BL2 + / BL3) tecido. Trabalhar com HIV infecciosas em instalações de imagem deve ser aprovado por seu escritório de biossegurança institucional local. </li><li> Transfecção do Jurkats com o plasmídeo viral, HIV Gag iGFP usando o método nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 células por centrifugação por 10 min a 150 x g. Aspirar o sobrenadante e lavar as células de fosfato estéril salina tamponada (PBS). Centrifugar as células e ressuspender o sedimento a 97 mL do pré-aquecido V solução, nucleofector contendo suplemento do fabricante. Adicione três mL de endotoxina livre da mordaça iGFP HIV-plasmídeo (1 mg / mL) à suspensão de células e misture delicadamente. Transferir a suspensão de célula para uma cuvete e nucleofect usando o programa S-18. Transferir imediatamente as células a 3 mL de mídia Jurkat pré-aquecido a cultura sem antibióticos. </li><li> Para preparar CD4 + células-alvo para as sinapses virológica, obtemos células mononucleares do sangue periférico de buffy casacos usando um protocolo de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) padrão. Células T CD4 + são, então, negativamente selecionado usando um kit de isolamento magnético talão (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Estes podem ser criogenicamente armazenados em N2 líquido, em alíquotas de 5 x 10 6 cells/500 mL de meios de congelamento (90% de soro fetal bovino DMSO serum/10%). Descongeladas CD4 + células T primárias são cultivadas em RPMI 10% FBS, suplementado com 10 unidades / mL de IL-2. </li></ol> (Dia 2) 3. Recuperação de células vivas a partir Jurkats Transfectados com HIV Gag iGFP e coloração das células-alvo com corantes fluorescentes <ol><li> Permitir que as células Jurkat para se recuperar da transfecção durante a noite. Em seguida, retire os detritos celulares por centrifugação em um gradiente de Ficoll Hypaque material de densidade. Dispense 1,5 mL de Ficoll-Paque para o fundo de um tubo de 15 mL cônico. Delicadamente sobrepor este material com o gradiente Jurkats transfectadas em um volume de 5 mL de RPMI. Centrifugar as células a 400 xg por 20 min à temperatura ambiente com o freio. Remova cuidadosamente as células a partir da interface media / Ficoll usando uma pipeta. Transferi-los para um novo tubo de 15 mL cônico. Diluir as células com RMPI para um volume total de 15 mL e centrifugar a 300 xg por 10 min. Ressuspender o sedimento em 3 mL de meios de cultura em um Jurkat dois centímetros bem (6 bem-placa) e as células voltem ao tecido da cultura incubadora. </li><li> Para diferenciar as células-alvo a partir de células de doadores em experimentos de transferência de célula-célula que prelabel as células CD4 + alvo com corantes fluorescentes. CD4 + primárias células T são rotulados do mesmoing antes de usar. Tivemos excelente sucesso células T rotulagem com as duas CellTracker e corantes CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Enquanto a concentração de corantes e tempos de incubação deve ser otimizada, dependendo do corante especial e com o tipo, um protocolo de representante segue. Pellet 4 x 10 6 CD4 + primárias células T, girando a 400 xg por 10 min. Lavar as células com 5 mL de PBS e ressuspender em 2 mL de PBS. Adicionar CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) para uma concentração final de 1,5 mM e incubar a 37 ° C por 20 min. Adicionar 8 mL de mídia Jurkat completa e centrifugar a 400 xg por 10 min. Ressuspender as células em 3 mL de meio completo suplementado com 10 unidades / mL de IL-2 e coloque na cultura de tecidos incubadora durante a noite. </li></ol> (Dia 3) 4. Monitoramento de transferência de célula para célula de HIV Gag iGFP usando imagens de células vivas Nós usam rotineiramente HIV Gag iGFP células Jurkat transfectadas 48 horas após a transfecção. No entanto, temos utilizado com sucesso células nas primeiras 24 horas, e tão tarde quanto 72 horas pós-transfecção. <ol><li> Aproximadamente 48 horas após a transfecção, HIV Gag iGFP-Jurkats expressar são contados, lavado com CO 2 de mídia independente (Invitrogen, Carlsbad, CA), e ressuspenso em células vivas mídia de imagem (CO 2 de mídia independente, 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina e 100 mg / ml, 10 unidades / mL IL-2) em uma concentração de 1-3 x 10 7 células / mL. </li><li> Em uma forma similar, lavar e ressuspender rotulados CD4 + primárias células T com uma concentração de 1-3 x 10 7 células / mL nos meios de comunicação de imagens de células vivas. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP transfectadas com CD4 Jurkats principal + células T na proporção 1:2 ou 1:3 e de carga em uma cultura de tecidos tratados, gás permeável, MicroChamber (Ibidi, Verona, WI). Por exemplo, misturar 20 mL de HIV Gag iGFP-Jurkats transfectadas com 40 mL de rotulados CD4 + células T primárias. Carga de 50 mL desta mistura em uma câmara de Ibidi e selar a câmara com plugs. Segura as velas envolvendo a ficha / Ibidi interface de câmara com parafilme. </li></ol> 5. Considerações para as plataformas de microscopia: spinning disco de imagem confocal Depois de carregar uma câmara de imagem Ibidi com células, nós imediatamente montar o dispositivo em um microscópio invertido óptico (Olympus iX71, Center Valley, PA). A câmara de Ibidi devem ser transferidos para o microscópio apenas por BL2 + pessoal treinado laboratório usa roupas de segurança adequadas. Apesar de viver de células de imagem comumente utiliza câmaras de incubação caro para manter um ambiente estável a 37 ° C, esta foi realizada por meio de um aquecedor simples e econômica termostática (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA), juntamente com uma ponta termopar tipo T montada ao lado a amostra para o gabarito temperatura adequada. Temos encontrado usando CO 2-mídia independente nos permite manter a viabilidade celular de alta, evitando o uso de uma câmara de CO 2. Para atenuar a plataforma contra flutuações de temperatura na sala e para bloquear a luz ambiente de fundo, um preto grande sudário é drapejado sobre a configuração do microscópio / aquecedor de toda a criação de um bolsão de ar com isolamento em torno do sistema. Isso reduz bastante variação de temperatura e deriva de exemplo associado relacionadas com a temperatura, mas exige pré-aquecimento por 30 minutos antes da montagem da amostra. 6. Processamento de Dados Transferência de Aquisição e Imagem As imagens são tiradas com um 60x 1,42 NA objetivo de imersão em óleo (UPlanApo N, Olympus) como a alta abertura numérica (NA) melhora muito a resolução. Para criar imagens 3D confocal, a verificação é realizada por uma unidade de disco giratório confocal (CSU-10, Yokagawa, Japão) que, simultaneamente, usa&gt; 800 pontos confocal para aumentar drasticamente a taxa de varredura. Para complementar a sua velocidade, o CSU-10 é emparelhado com um altamente sensível elétron-multiplicando dispositivo carregado de acoplamento (EMCCD, ixon + 897, Andor Technologies, Irlanda) da câmera para permitir rápida, de imagens com pouca luz, que reduz a fotodegradação e fototoxicidade. A fonte de luz de fluorescência é um multi-comprimento de onda ARKR ion de gás laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), onde o comprimento de onda desejado (488 nm) e potência do laser medido logo antes da objetiva do microscópio (&lt;1 mW) são selecionados por um acústico- óptico sintonizável filtro (AOTF), (Andor Technologies). Para reduzir ainda mais fotobranqueamento e prolongar o tempo de imagem total, o AOTF rapidamente (microssegundos) desliga o feixe de laser cada vez que a câmera está inativo (10-20 ms) enquanto a imagem recém-adquirido é entregue a partir do CCD (15-30 exposição ms) para o computador. A luz laser é acoplado no sistema de disco giratório com um quad-band 405/488/568/647 dichroic espelho (Semrock, Rochester, NY). Emissão de fluorescência é filtrada usando um filtro passa-banda 525 / 50 (Semrock) dentro de uma roda de filtros (Ludl Produtos eletrônicos, Hawthorne, NY) montado bntre a câmera EMCCD ea unidade de disco confocal girando. Todo o hardware e aquisições, incluindo um z-stage (Mad City Labs, Madison, WI), são controlados pelo iQ Andor v1.8 software. Para maximizar a velocidade de aquisição em torno de 1,2-1,9 segundo pilhas de imagens 3D, de culturas na região de gravação de câmera de baixo para EMCCD área imediata da célula par de. Além disso, à custa de algumas informações em z, um grande passo z entre 0,45-0,75 M pode ser usada para acelerar a aquisição. Imagem sob essas condições pode durar até seis horas - utilizando segmentos minutos contínuos 20-60 - com fotobranqueamento mínimo. Ao todo, cada segmento de dados ocupa tipicamente 50-20 Gb de espaço como dezenas de milhares de imagens são tomadas. Para facilitar o transporte e análise dos arquivos de dados de grande porte, cada conjunto de aquisição precisa ser quebrado e exportada como TIFF segmentos 1 Gb de arquivos de imagem usando o Andor iQ v1.8 software. A partir daqui, muitos pacotes de software excelentes estão disponíveis para análise de imagem, tais como Metamorph, Volocity e ImageJ (recomendamos sua variação Fiji). Quando dois marcadores fluorescentes devem ser controladas, nós gravar simultaneamente os dois sem abrandar a aquisição através de um &quot;modo de ecrã dividido.&quot; Ambos os marcadores está animado por duas linhas diferentes de laser ARKR menos uma vez (muitas vezes 488 e 568 nm). Inserido diretamente diante da câmera EMCCD é uma imagem de divisão (OptoSplit II, Cairn, Kent, Reino Unido) que separa as duas imagens diferentes. Cada imagem é, então, independentemente filtrada usando filtros de fluorescência (Semrock) e projetados lado a lado da câmera ao mesmo tempo criando o &quot;split-screen&quot; efeito. Este seria, então requerem corte manual e alinhamento das imagens mais tarde, em processamento de imagem. 7. Considerações para Processamento de Imagem e Análise de Dados Nós normalmente executam análise de imagem com Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) em computadores Macintosh (Apple, Inc). Spinning disco laser de imagens de microscopia confocal são primeiramente ajustados em sua intensidade para corrigir fotobranqueamento, então deconvolved com Volocity. Medições de intensidade e acompanhamento de puncta Gag é realizada com o módulo de Quantificação Volocity. Para conjuntos de imagens onde o movimento relativo a uma sinapse pré-formado precisa ser calculado, um algoritmo de monitoramento automatizado é empregado que monitora o botão sináptico durante toda a seqüência. Inspeção manual das regiões de interesse definidas pelo software autotracking devem ser realizados para confirmar que o software tem rastreado corretamente o objeto desejado. Para objetos onde o contraste com os objetos no ambiente é muito fraco, rastreamento manual pode ser feita numa base de quadro-a-quadro. O pacote de software Volocity permite a exportação de XYZ localização, volume e sinal integrado os objetos desejados. A distância entre a sinapse e velocidade do objeto rastreado são calculados através da normalização do movimento para o centro do botão sináptico. 8. Resultados representante Dentro de 10 a 15 minutos de mistura deve ser capaz de visualizar HIV Gag iGFP células Jurkat expressar aderir a CD4 + células T primárias. Imagem destes conjugados, pode-se avaliar os movimentos de puncta mordaça nas células infectadas, bem como em células-alvo após synaspe. Pode-se observar o movimento da mordaça iGFP-puncta em células-alvo logo após sinapses são formadas.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos aqui um método simples para visualizar a transmissão de HIV de célula-célula. Uma pesquisa recente de nosso laboratório e outros sugere que este pode ser o modo predominante de transmissão do HIV entre as células T. O método descrito aqui utiliza uma forma recombinante do HIV, chamado HIV-Gag iGFP, que carrega um geneticamente codificado tag proteína verde fluorescente no estruturais da mordaça proteína do núcleo,. Por causa dos níveis elevados de GFP produzidos em cada partícula do vírus, este clone replicação competente do HIV permite aos pesquisadores para rastrear partículas de vírus individuais em tempo real. Este vírus devem ser especialmente útil em estudos sobre a transferência de montagem e célula-célula de HIV. A transferência de HIV por célula-célula de transferência é altamente eficiente. Durante uma hora, três co-cultura, de rotina, vemos vírus transferido para 20-30% de células primárias de T, avaliado por citometria de fluxo. Eficiências semelhantes são qualitativamente visto durante imagens de células vivas. Infectadas por vírus de células T começam sinapses formando com células primárias de T não infectadas, quase imediatamente após o início da co-cultura. Interessante, nem todas as células T primárias são capazes de interagir com as células infectadas pelo HIV Jurkat apesar interações forçadas com laser pinças (observações não publicadas, GM). HIV-Gag iGFP será sem dúvida útil para determinar subpopulações de células T que são mais suscetíveis a célula-transferência, tanto in vitro como in vivo.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

Fundindo a proteína verde fluorescente para suas proteínas favorito, os biólogos têm agora a possibilidade de estudar vivos complexos processos celulares através de microscopia de fluorescência de vídeo. Para acompanhar os movimentos da proteína do núcleo do vírus da imunodeficiência humana durante a transmissão célula a célula do vírus da imunodeficiência humana, temos GFP-tagged a proteína Gag no contexto de um clone infeccioso molecular do HIV, chamado HIV-Gag iGFP. Estudamos esse clone viral por microscopia confocal de vídeo. No experimento seguinte visualizadas, nós transfectar uma linhagem de células T humanas com HIV Gag iGFP, e nós usamos fluorescente etiquetado CD4 + não infectadas as células T para servir como células-alvo para o vírus. Usando o rótulos diferentes fluorescentes podemos facilmente seguir a produção viral e transporte através de estruturas chamadas sinapses intercelular virológica. Simples câmaras de gás permeável imagens nos permitem observar sinapses com microscopia confocal viver de minutos a dias. Estas abordagens podem ser usadas para rastrear as proteínas virais como eles se movem na de uma célula para outra.

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K visualizações.  Mount Sinai School of Medicine. Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Vídeo: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Imunologia e Infecção

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Estrutura do HIV-1 Assembléias Cápside por Cryo-Microscopia eletrônica e reconstrução iterativa helicoidal espaço-Real

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...