Las imágenes vibratorias altamente multiplexadas proporcionan un enfoque óptico de una sola toma para interrogar múltiples marcadores de proteínas en tejidos con resolución subcelular. Esta plataforma proporciona una imagen completa de las interacciones proteicas de los sistemas biológicos. La principal ventaja de esta técnica es su multiplexidad sin ciclos.
Esta técnica es particularmente adecuada para aplicaciones donde las estrategias de ciclismo no funcionan bien, como en secciones de tejido grueso. Este método permite la caracterización celular individual in situ para comprender las estructuras del sistema complejo, como la construcción de atlas de tejidos, el fenotipado de microambientes tumorales y el circuito cerebral de perfiles. Para comenzar, prepare aproximadamente bicarbonato de sodio molar 0.1 en tampón PBS a PHA 0.3 para usarlo como tampón de conjugación y guárdelo a cuatro grados Celsius.
A continuación, prepare tres milimolares solución de sonda MARS con éster de n-hidroxisuccinimida en sulfóxido de dimetilo anhidro. Disolver los sólidos de anticuerpos en el tampón de conjugación a una concentración de dos miligramos por mililitro. Para los anticuerpos disueltos en otros tampones, concéntrelos en un filtro centrífugo y luego agréguelos al tampón de conjugación a una concentración de uno a dos miligramos por mililitro.
Para realizar la reacción de conjugación para anticuerpos secundarios, agregue 15 veces el exceso molar de solución de colorante a la solución de anticuerpos en un vial de vidrio lentamente con agitación e incube la mezcla de reacción a temperatura ambiente con agitación durante una hora. Para realizar la purificación, prepare la suspensión agregando 10 mililitros de polvo de resina de filtración de gel en 40 mililitros de tampón PBS en un tubo de 50 mililitros. Mantenga la solución en un baño de agua a 90 grados centígrados durante una hora.
Luego decanta el sobrenadante, agrega el PBS hasta 40 mililitros y almacena la suspensión a cuatro grados centígrados. Empaque la columna de exclusión de tamaño con la solución de lodo a la altura de 10 a 15 centímetros, luego enjuague y lave la columna con aproximadamente 10 mililitros de PBS para empacar aún más la resina. Posteriormente, pipetee la mezcla de reacción de conjugación a la columna.
Después de cargar la mezcla de reacción, agregue inmediatamente un mililitro de PBS como tampón de elución. Después, recoja el eluyente de la solución conjugada observando el color de la columna o midiendo la absorbancia a 280 nanómetros. Usando el filtro centrífugo, concentre la solución recolectada a uno o dos miligramos por mililitro.
Usando una pluma hidrofóbica, dibuje un límite alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva. Luego incube los tejidos con 0.3 a 0.5% PBST durante 10 minutos y un tampón de bloqueo durante 30 minutos. Para preparar la solución de tinción primaria, agregue todos los anticuerpos primarios a 200 a 500 microlitros de tampón de tinción a las concentraciones deseadas.
Centrifugar la solución de tinción primaria a 13, 000 veces G durante cinco minutos y usar el sobrenadante si aparece precipitado. Luego incube el tejido en la solución primaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante uno o dos días. Lave los portaobjetos tres veces con 0.3 a 0.5% PBST durante cinco minutos a temperatura ambiente en un frasco de pie de portaobjetos y asegúrese de que los pañuelos estén sumergidos en la solución.
Más tarde, incuba el tejido en 200 a 500 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos. Para preparar la solución de tinción secundaria, agregue todos los anticuerpos secundarios a 200 a 500 mililitros de tampón de tinción con las concentraciones deseadas. Luego centrifugue la solución de tinción secundaria a 13, 000 veces G durante cinco minutos y use el sobrenadante si aparece precipitado.
A continuación, incube los tejidos en 200 a 500 microlitros de solución secundaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante uno o dos días. Luego lave las diapositivas dos veces con 0.3 a 0.5% PBST a temperatura ambiente durante cinco minutos cada una. Además, incube con 200 a 500 microlitros de solución DAPI durante 30 minutos.
Una vez más, lave las diapositivas tres veces con PBS a temperatura ambiente durante cinco minutos cada una y transfiera las secciones de tejido flotantes a las diapositivas de vidrio con la pipeta de gota de vidrio. Extienda el pañuelo con un cepillo de pañuelos y limpie el entorno con toallitas si es necesario. Posteriormente, monte el tejido en una gota de reactivos antidesvanecimiento con una funda de vidrio y asegúrelo con esmalte de uñas.
Para realizar imágenes eprSRS multicanal, ajuste la potencia láser del haz de la bomba a 10 a 40 milivatios y el haz stokes a 40 a 80 milivatios en el panel de control láser. A continuación, establezca el tiempo de permanencia de píxeles en dos a cuatro microsegundos y utilice varios fotogramas con un promedio de 10 a 20 fotogramas en el software de microscopía. Además, ajuste las constantes de tiempo del amplificador de bloqueo a la mitad del tiempo de permanencia de píxeles.
Las imágenes de colorante Raman de distintos marcadores de proteínas y células HeLa fijas en la corteza cerebral del ratón fijadas en paraformaldehído y el tejido FFPE renal húmedo se realizaron a través del marcado inmunológico. Las imágenes inmuno-eprSRS de células HeLa con una alfa-tubulina revelaron estructuras subcelulares finas como los microtúbulos. Las imágenes eprSRS de astrocitos teñidos mars 2145 y neuronas granulosas cerebelosas teñidas MARS 2228 en tejido cerebral de ratón demostraron patrones tridimensionales con resolución subcelular.
Se realizaron las imágenes en tándem de fluorescencia SRS de siete colores de hormonas y factores de transcripción en tejido de islotes de ratón congelados. Las imágenes obtenidas revelaron un buen contraste y patrones correctos. Se realizaron las imágenes en tándem de fluorescencia SRS de ocho colores de marcadores de tipo celular en tejidos cerebelosos de ratón fijados en paraformaldehído.
Se identificaron diferentes tipos de células, como las neuronas granulares cerebelosas, las neuronas de Purkinje, los astrocitos, los oligodendrocitos y las neuronas GABAérgicas. Este procedimiento se puede combinar aún más con la limpieza de tejidos para realizar imágenes de proteínas altamente multiplexadas en tejidos gruesos intactos. Nuestro grupo ha desarrollado un protocolo de limpieza de tejidos adaptado a tinte Raman para ello.
