El apoyo de la JDRF, el NIH (R01-DK081469), el Estado de Pennsylvania (Centro de Excelencia en Medicina Regenerativa de concesión 4100043362), March of Dimes (Basil O&#39;Connor arranque Premio de Investigación Académico) y la Universidad de Pennsylvania piloto DERC y la viabilidad de subvención (DK19525).

1. Los tejidos etiquetado con CldU y UDI <ol><li> Disolver análogos de la timidina (CldU o UDI) en el agua. Pesar ml 1 mg / de cada producto químico y añadir a separar las botellas de vidrio de agua destilada. Por lo general preparar 1 litro de cada uno a la vez. </li><li> Disolver los productos químicos en una placa de agitación o de otro tipo de agitador. CldU se disuelve en 10 min. de agitación a temperatura ambiente. UDI exige más de una hora de agitación a 37 ° C en un agitador. Las fuentes de agua puede influir en la solubilidad UDI. Si UDI sigue sin suspensión después de la noche temblando, trata de una fuente limpia de agua. Las soluciones se almacenan a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Administrar la solución que contiene timidina primero (ya sea CldU o UDI) a los ratones durante el periodo de etiquetado deseado. No permita que los ratones para que tuvieran acceso al agua sin etiqueta durante el período de etiqueta. Cuando el período de etiquetado designado se ha completado, comienza un periodo de lavado con agua sin etiqueta por lo menos 24 horas (los análogos de la timidina que contiene suero tienen una vida media de varias horas). Administrar la solución que contiene timidina segunda (ya sea CldU o UDI) a los ratones durante el periodo de etiquetado deseado. Botellas de relleno de agua con regularidad para evitar la deshidratación! </li><li> Por otra parte, los ratones pueden ser etiquetados por la inyección intraperitoneal de CdlU secuencial y UDI. Prepare CldU o CDI en 10 mg / ml de concentración. UDI puede requerir gota a gota, además de la solución concentrada de hidróxido sódico seguido de una agitación vigorosa para entrar en suspensión. No agregue exceso de hidróxido sódico. Añadir una gota de hidróxido de sodio a una solución de 10 ml de UDI seguido por una hora de agitación a 37 ° C en un agitador. Si no es así en la solución, repetir la adición de hidróxido de sodio. Inyectar 100 mcg por g de peso corporal en el espacio intraperitoneal. </li><li> Portaobjetos de control son esenciales para este protocolo. Como resultado de ello, le recomendamos los investigadores llevar a cabo diversas variaciones de etiquetado análogo de la timidina para asegurar la sensibilidad y especificidad. Estas deben incluir: 1. Los ratones que fueron etiquetados sólo con CldU, 2. Los ratones que fueron etiquetados sólo con CDI, 3. Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial con CldU UDI y luego 4. Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial en orden inverso, primero con el IDU y CldU entonces, cinco ratones a los que se burlan etiquetados con agua solamente. Cuando se aprende a la etiqueta con CldU y UDI, los investigadores siempre deben llevar a cabo todo el protocolo con los 5 juegos por encima de los portaobjetos de control de los tejidos de interés. </li></ol> 2. Cosecha de tejidos, fijación, y preparación de los portaobjetos <ol><li> Utilizando el anestésico apropiado, lleve a cabo una sobredosis letal y sacrificio del ratón a través de desangrado. Eliminar el tejido fresco y arreglar con un 4% paraformalehyde a 4 ° C durante 24 horas. La transferencia de tejido para amortiguar 01:04 formalina y se almacenan a 4 ° C para la incrustación. </li><li> Por otra parte, realizar sobredosis letal y perfundir el ratón a través del ventrículo izquierdo cardíaco con solución salina hasta que la sangre se elimina del cuerpo, inmediatamente después perfundir con 30-50 cc de paraformaldehído al 4%. Eliminar los tejidos de interés y almacenar en búfer 01:04 formol a 4 ° C para la incrustación. </li><li> Después de la deshidratación del tejido y la inclusión en parafina, corte de 5 micras secciones de tejido y el lugar en portaobjetos de cargos. Hornear las láminas a 65 ° C durante 16 horas para asegurar la adhesión del tejido a la diapositiva (esencial con medidas de recuperación de antígeno más adelante). </li></ol> 3. La deshidratación, la permeabilización, y Antigen recuperación <ol><li> Retire el exceso de parafina por inmersión de diapositivas en dos baños de xileno durante 5 min. cada uno. </li><li> Rehidratar el tejido mediante la inmersión de diapositivas en etanol diluido en agua: 100, 95, 90, 80 70 y el 50%. Sumerja los portaobjetos durante 3 minutos. en cada concentración, a partir de 100% y va hasta un 50% de la inmersión final. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 5 minutos. en 1x PBS. </li><li> Permeabilizar las células mediante la inmersión de las diapositivas en Triton X-solución al 0,2% durante 5 minutos (recién hecho cada vez). </li><li> Preparar diapositivas para la recuperación de antígenos del tejido microondas. Colocar los portaobjetos en un vaso de vidrio con un volumen suficiente 0,01 M pH 6,0 tampón de citrato de sodio, por lo que la solución cubre 5 cm por encima de la parte superior de las diapositivas para dar cuenta de la pérdida por evaporación. </li><li> Diapositivas de microondas hasta que la solución está en ebullición (3-10 min. A plena potencia). Reducir la potencia hasta que la solución es hervir lentamente (10-80%) y continuar por otros 20 min. Compruebe microondas periódicamente para asegurar la solución se mantiene a fuego lento. </li><li> Vaso lugar con diapositivas en un banco-superior y deje que se enfríe ligeramente a temperatura ambiente, (aproximadamente 2 horas). </li><li> Confirmar que se desliza están a temperatura ambiente usando un termómetro. </li><li> Sumerja los portaobjetos en 1.5N HCL durante 40 minutos. a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces en 1X PBS, 5 min. por lavado. </li></ol> 4. Anticuerpos primarios y secundarios <ol><li> Es importante que las diapositivas se mantienen muy húmedos a través de todo el protocolo. Tejido seco se han auto mucho másFluorescencia, por lo que las imágenes resultantes inutilizable. Para prevenir la muerte, el proceso de una diapositiva a la vez. </li><li> Círculo de cada sección en las diapositivas con un líquido de bloqueo (es decir, cera) pen. Colocar los portaobjetos en el recipiente de 1x PBS. </li><li> Haga una cámara de incubación húmeda mediante la colocación de toallas de papel mojadas colocadas en el fondo de un recipiente de plástico hermético. </li><li> Constituyen la solución de bloqueo de suero burro 10% diluido en PBS 1x. Es importante para cubrir completamente cada sección con la solución. Para las secciones de tejidos que son 1 x 1,5 cm, un volumen de 50 micro-litros de solución por cada sección es suficiente. </li><li> Añadir la solución de bloqueo a las diapositivas. Eliminar diapositivas de 1x PBS y eliminar el exceso de líquido golpeando suavemente el borde de diapositivas en una pila de toallas de papel seca. Lugar de diapositivas en la cámara de incubación y añadir 50 micro-litros de solución de bloqueo del 10% de cada sección. Cuando todas las diapositivas se han completado cerca del recipiente y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Preparar la dilución del anticuerpo primario para detectar UDI. Diluir el ratón anti-BrdU a una concentración de 1:250 en burro 5% de suero hecho en 1x PBS. Elimine el bloque de solución de diapositivas y vuelva a colocar en la cámara de incubación. Añadir el anticuerpo primario por encima de cada sección y se incuba durante la noche a 4 ° C. </li><li> Prepare lavado de alto rigor (que reduce al mínimo vinculante de ratón anti-BrdU antisueros CldU). Maquillaje fresco tampón de baja TBST sal (36 mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). Que se necesitan 40 ml de solución tampón por par de guías. Añadir 40 ml de buffer a cada tubo cónico de 50 ml. Antes de agregar diapositivas, precalentar la solución a 37 ° C. </li><li> Dos a la vez, eliminar las diapositivas de la cámara de incubación, el lugar de nuevo hacia atrás (para que las muestras de tejido cara lejos el uno del otro) y el grifo principal anticuerpo en exceso. Colocar los portaobjetos en los tubos llenos de TBST baja en sal y la tapa. Agitar los tubos durante 20 minutos. en un temblor de cultivo bacteriano incubadora con la temperatura a 37 ° C, y la velocidad ajustada a 225 rpm. </li><li> Este lavado dos veces en PBS 1X. 5 min. por lavado. </li><li> Prepare la siguiente solución primaria de anticuerpos para la detección de antígeno tisular CldU y, si lo desea. Diluir rata anti-BrdU a una concentración 1:250 en burro 5% de suero hecho en 1x PBS. Diluir antisueros primaria contra el antígeno del tejido en el trabajo de concentración en la solución de anticuerpo primario. </li><li> Toque en el exceso de PBS 1x fuera de las diapositivas, y colocarlos en la cámara de incubación. Añadir el anticuerpo primario a cada sección y se incuba durante la noche a 4 ° C. </li><li> Este lavado dos veces en PBS 1X. 5 min. por lavado. </li><li> Prepare la solución de anticuerpo secundario. Diluir Cy2 burro anti-rata a 1:250 y Cy5 burro anti-ratón de 1:500 en una solución 1X PBS que contenía 5% de suero de burro. Añadir Cy3 secundaria para detectar las principales especies de antisueros tejido antígeno. Además, diluir una solución madre 0,4 mg / ml de DAPI a 1:150 en una solución de anticuerpo secundario. </li><li> Toque en el exceso de PBS 1X y se desliza a cabo en la cámara de incubación. Añadir la solución de anticuerpo secundario para cada sección y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Este lavado dos veces en PBS 1X. 5 min. por lavado. </li><li> Toque en el exceso de PBS 1X fuera de las diapositivas y se adhieren con cubierta de vidrio prolongar Oro anti-fade medios de montaje (NO use Vectashield con tintes dyanine!). Pulse sobre cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire. Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 5. Imágenes y análisis <ol><li> La imagen del tejido de interés con un microscopio de fluorescencia equipado con una fuente de energía de la luz alta, apocromático plan de los objetivos, y una cámara de microscopio de alta eficiencia (por ejemplo, Hamamatsu Orca ER). Captura de imágenes en la AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antígeno tisular), y Cy5 canales (UDI). Combinar imágenes para crear un único multi-capa de archivo de imagen. </li><li> Si se realiza correctamente, los núcleos teñidos DAPI será homogénea brillante. Antígenos del tejido (por ejemplo, insulina) deben revelar las células de interés. Si la tinción con DAPI o tejido de antígeno es débil o inconsistente, deslice sumergirse en 1X PBS durante la noche para quitar la tapa deslizante y repetir la aplicación de antisueros secundaria. </li><li> Centrarse en el antígeno en el tejido Cy3. Compruebe CldU y manchas en la UDI Cy2 y Cy5 canales, cambiar entre canales. Buscar la posible reactividad cruzada entre los marcadores, como se indica por el exceso de UDI y CldU co-positividad. Busque los tejidos que contienen sólo CldU o UDI. La falta de núcleos CldU o UDI positivo puede indicar un problema técnico con el etiquetado o las manchas. En este caso, busque un tejido altamente replicativa (por ejemplo, nodo linfático). </li><li> Analizar las imágenes. Mostrar las capas que contienen el antígeno DAPI y tejidos. El uso de un marcador de pizarra blanca en la mano dominante y un contador de células en la mano no dominante, marque cada núcleo con una marca de contraste con un marcador de borrado en seco (también conocido como blanco marcador de la placa). Recuento de células DAPI positiva en el tejido de interés. Registro total de células. Use una goma de borrar en seco para eliminar las marcas. Visualización de capass DAPI, antígeno tisular, y CldU. Recuento de células CldU positiva dentro del tejido de interés. Registro CldU recuento de células, pero no borrar las marcas. Cambiar la pantalla para visualizar las capas de tejido que contiene el antígeno, CldU y UDI. Conde CldU UDI células positivas doble. Valor de grabar, borrar todas las marcas, y mostrar capas con DAPI, antígeno tisular, y UDI. Cuente el número total de células positivas UDI en el tejido de interés. Registro UDI recuento de células. </li></ol> 6. Resultados representante Hemos marcado secuencial 6 semanas de edad ratones hembra con CldU durante una semana y luego UDI durante dos semanas, seguido por el sacrificio inmediato. Páncreas se tiñeron para detectar CldU, UDI, y la insulina (un antígeno tisular), así como DAPI. Islotes se tiñeron de manera uniforme con la insulina. CldU núcleos teñidos eran distintos de los núcleos teñidos UDI (Figura 2). Muchos núcleos fuera de la isleta se CldU UDI co-positivos (Figura 2, abajo a la derecha, flechas blancas). Una célula de la insulina positivo solo había tinción nuclear, tanto para CldU y UDI (Figura 2, abajo a la derecha, flecha magenta). Ratones. Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo a las directrices del Comité de IACUC del Hospital de Niños de Filadelfia. Mujer B6.129 F1 ratones de tipo salvaje fueron adquiridos de Taconic (Germantown Nueva York), con sede en las instalaciones de animales de laboratorio en el Hospital de Niños de Filadelfia, y se alimenta del ratón Dieta de 5015 PMI Nutrición Internacional (Richmond. Indiana). Etiquetado de la estrategia. Mediante el etiquetado, el caso de la división celular, primero con CldU (marcado en verde en este esquema) y la segunda división celular con la UDI (marcado en rojo en este esquema), secuencial los resultados de la división celular en las células co-marcado con ambas CldU y UDI (verde / rojo) . Los resultados representativos de la timidina etiquetado de la facturación de células pancreáticas en ratones. La imagen de inmunofluorescencia de un páncreas de un ratón con los islotes de Langerhans en el centro. Ratón fue infundido con CldU durante 1 semana y luego UDI por 2 semanas en el agua potable antes de su sacrificio inmediato. Muestra de páncreas se ha procesado como se describe en el protocolo. 40x imágenes objetivas, con distintas capas se muestra adecuado para el conteo. Imágenes fusionadas contienen DAPI (blanco) CldU (verde), UDI (rojo), insulina (amarillo). (Superior izquierda) DAPI y la insulina. (Superior derecha) CldU y la insulina. (Inferior izquierda) IDU y la insulina. (Inferior derecha) CldU, UDI, y la insulina. Barra de escala: 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Estrategia de etiquetado. Mediante el etiquetado, el caso de la división celular, primero con CldU (marcado en verde en este esquema) y la segunda división celular con la UDI (marcado en rojo en este esquema), secuencial los resultados de la división celular en las células co-marcado con ambas CldU y UDI (verde / rojo) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Los resultados representativos de la timidina etiquetado de la facturación de células pancreáticas en ratones. La imagen de inmunofluorescencia de un páncreas de un ratón con los islotes de Langerhans en el centro. Ratón fue infundido con CldU durante 1 semana y luego UDI por 2 semanas en el agua potable antes de su sacrificio inmediato. Muestra de páncreas se ha procesado como se describe en el protocolo. 40x imágenes objetivas, con distintas capas se muestra adecuado para el conteo. Imágenes fusionadas contienen DAPI (blanco) CldU (verde), UDI (rojo), insulina (amarillo). (Superior izquierda) DAPI y la insulina. (Superior derecha) CldU y la insulina. (Inferior izquierda) IDU y la insulina. (Inferior derecha) CldU, UDI, y la insulina. Barra de escala: 100μm.

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Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo en las instalaciones de animales en el Hospital de Niños de Filadelfia, de acuerdo con las directrices del Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC).

Nuestro enfoque de la timidina enfoque basado en el etiquetado la renovación celular tiene muchas aplicaciones potenciales en la investigación biomédica. Hasta la fecha, nos hemos concentrado en el páncreas, pero también hemos aplicado esta estrategia para examinar la renovación celular de la piel, intestino, hígado, riñón suprarrenal, testículos, ovarios, tiroides, ganglios linfáticos, la hematopoyesis, y el cerebro 1. Debido a la renovación celular varía de un tejido a otro, las estrategias de etiquetado debe ser personalizado para obtener la información más convincente desde el órgano de interés. Morrison y sus colegas utilizaron CldU UDI y de un día para cada etiqueta de la hematopoyesis 2. Kuhn y sus colegas utilizan CldU UDI y durante 4 días cada uno para detectar la división celular en la regeneración del miocardio 3. Por el contrario, hemos utilizado CldU UDI y de hasta 9 meses en total para etiquetar el volumen de negocios de células basales en los islotes pancreáticos, un tejido con una facturación mínima de células como las edades de los animales 1,4-6. La posible aplicación más evidente de nuestra estrategia de etiquetado para los estudios para definir la renovación celular en la homeostasis del tejido. Sin embargo, nuestra técnica tiene varias aplicaciones potenciales. Por ejemplo, recientemente aplicado esta técnica para identificar la transformación oncogénica en los tejidos, donde las áreas focales de aumento de la replicación puede ser fácilmente identificado por una mayor incorporación de CldU o CDI 5. Morrison y sus colegas utilizaron CldU UDI y de un día cada uno para determinar el comportamiento de la etiqueta de retención de las células madre hematopoyéticas 2. También hemos aplicado el etiquetado secuencial análogo de la timidina para determinar si la amplificación de tránsito de las células contribuyen al crecimiento o la renovación de los tejidos 1. En esta administración la aplicación secuencial de los análogos de la timidina representa un nuevo enfoque para el estudio de los orígenes y la supervivencia de las células que participan en la homeostasis del tejido. Análogos de la timidina no debe utilizarse con prudencia. Análogos sintéticos timidina tienen efectos secundarios potenciales de las células en división, y su uso en teoría podría poner en peligro la renovación de células de animales en crecimiento. Análogos de la timidina se han utilizado como agentes radiosensibilizadores para pacientes con cáncer, y puede retrasar la renovación celular. Por ello, instamos a los investigadores a investigar con cautela por la toxicidad potencial en el tejido de interés. Por ejemplo, Trumpp y sus colegas encuentran que sistémica BrdU puede obligar a las células madre hematopoyéticas para entrar en el ciclo celular 7. Por ejemplo, Rutter y sus colegas observaron que las altas dosis de análogos de la timidina son tóxicos para el desarrollo de páncreas 8. Más recientemente Hellerstein y sus colegas de KineMed, Inc. encontró que BrdU administración retrasa la proliferación intra-islote de 16 a 25% utilizando una técnica patentada pesados ​​etiquetado del agua 9. Los preparativos islote todo utilizado por Hellerstein y sus colegas contenidos endocrinos y muchas otras no endocrinos tipos de células, que puede incluir hasta un 50% de las preparaciones de islotes total. Sin embargo, nos encontramos con que la infusión prolongada de BrdU no influye en la proliferación de células beta en ratones adultos jóvenes, según lo medido por la expresión de ki67 4. Del mismo modo, la administración prolongada de CldU y UDI no parece afectar a la expansión masa de células beta 1. Por otra parte, la proliferación de células beta tasas son equivalentes entre los ratones etiquetado con BrdU durante largos períodos de tiempo y de los ratones que sólo están marcados por unas cuantas horas (las tasas se normalizan a períodos de tiempo equivalente). En conjunto, estos resultados sugieren que los ratones puede tolerar con seguridad a largo plazo bajo la administración de dosis de los análogos de la timidina. Sin embargo, no podemos descartar la posible toxicidad de los análogos de la timidina en el crecimiento de las células beta del páncreas. Como resultado, se continúan realizando los controles de etiquetado cuando los ratones con análogos de la timidina, e instamos a otros investigadores a hacer lo mismo. Nuestra técnica de etiquetado secuencial análogo de la timidina no está exenta de dificultades y desafíos técnicos. Como resultado, los portaobjetos de control son especialmente importantes. Hemos generado un portaobjetos de control que consisten en varios tejidos de 1) Los ratones que fueron etiquetados sólo con CldU;.. 2) Los ratones que fueron etiquetados sólo con CDI;. 3) Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial con CldU y UDI;. 4) Los ratones que fueron etiquetados de forma secuencial en orden inverso, primero con el IDU y CldU entonces;. 5) Los ratones que son simulacros de la etiqueta sólo con agua. Cuando se aprende a la etiqueta con CldU y UDI, los investigadores siempre deben llevar a cabo todo el protocolo con los 5 juegos por encima de las diapositivas de los tejidos de interés. Reactividad cruzada entre leve y CldU UDI es un inconveniente lamentable pero inevitable para el etiquetado de los análogos de la timidina. La técnica CldU y UDI se basa en diferencias en las afinidades entre los antisueros que se derivaron originalmente contra BrdU en diferentes especies (ratón y rata). Nuestro protocolo, mientras que engorroso, está diseñado para minimizar la reactividad cruzada tales. En consecuencia, instamos cautela entre los investigadores que consideran que saltarse el paso (s) del protocolo. En particular, hemostenido problemas con antisueros secundarios que son de reacción cruzada entre el ratón y la rata. Esto puede ser minimizado por el uso de antisueros Jackson que están totalmente absorbidos por el cross-entre el ratón y la rata. De vez en cuando no detecta adecuadamente la incorporación de timidina. En estos casos es muy importante utilizar láminas positivas de control para determinar que los reactivos o el paso no estaba funcionando. Las dificultades son por lo general debido a la mala alícuotas de sueros, se desliza en seco, o permeabilización nuclear inadecuada. Hemos fracasado en la etiqueta con éxito el desarrollo de los embriones con UDI. Por lo tanto, no todos los tejidos pueden ser permeables a la UDI. Alternativas a la CldU y UDI de doble etiquetado análogo de la timidina en el horizonte. Edu (5-etinil-2 desoxiuridina) puede ser un sustrato para la detección de cobre química catalizada haga clic en 10,11. Métodos de detección de Edu no requieren la separación de las hebras de ADN, por lo que son altamente susceptibles de análisis por citometría de flujo 12. Edu es compatible, pero no de reacción cruzada con BrdU 10. Edu se ha utilizado para cuantificar el recambio celular de los tejidos del ratón, asimismo, de las células beta pancreáticas 13, L 14 células intestinales y de la epidermis 15. Edu es bastante caro en el momento ($ 1000 EE.UU. por 500 mg). Sin embargo, la detección de Edu parece ser mucho más sensible que la detección de BrdU 10. Por lo tanto, podría ser económicamente viable para combinar Edu y BrdU en lugar de CldU y UDI. Este método también podría permitir la detección de tres rondas de división celular en ratones triplemente etiquetados para Edu, CldU y UDI. En resumen, la técnica de etiquetado secuencial análogo de la timidina es un enfoque novedoso para la detección de la renovación celular. Esperamos que nuestro enfoque permite a otros científicos para cuantificar con mayor precisión la división celular, y esperamos que se abran nuevos paradigmas en la homeostasis del tejido.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

La medición precisa de la división celular es un reto fundamental en la biología experimental que se convierte cada vez más complejo cuando poco a poco las células en división son analizados. Métodos establecidos para detectar la división celular incluyen la visualización directa por microscopía de continuo en cultivo celular, la dilución de colorantes vitales como carboxifluoresceína éster di-aetate succinimidilo (CFSE), inmuno-detección de antígenos mitogénica como ki67 y PCNA, y los análogos de la timidina. Análogos de la timidina puede ser detectada por una variedad de métodos como la radio de detección de timidina tritiada, inmuno-detección de bromo-desoxiuridina (BrdU), cloro-desoxiuridina (CldU) y yodo-desoxiuridina (UDI), y la detección química de etinil-desoxiuridina (EDU). Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los diferentes análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos. Nuestro método permite a los investigadores para cuantificar con precisión dos rondas sucesivas de la división celular. Mediante la optimización de los protocolos de tinción nuestro enfoque puede detectar los análogos de la timidina dosis muy baja administra con el agua potable, segura de administrar a los ratones durante períodos prolongados de tiempo. Por lo tanto, nuestra técnica puede ser utilizada para detectar la renovación de células en los tejidos de muy larga duración. Óptimos resultados de la tinción immunofluoresent se puede lograr en múltiples tipos de tejidos, incluyendo el páncreas, piel, intestino, hígado, suprarrenales, testículos, ovarios, tiroides, ganglios linfáticos y el cerebro. También hemos aplicado esta técnica para identificar la transformación oncogénica en los tejidos. Además, hemos aplicado esta técnica para determinar si la amplificación de tránsito de las células contribuyen al crecimiento o la renovación de los tejidos. En este sentido, la administración secuencial de los análogos de la timidina representa un nuevo enfoque para el estudio de los orígenes y la supervivencia de las células que participan en la homeostasis del tejido.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos para cuantificar dos rondas sucesivas de la división celular. Esta estrategia es útil para detectar la renovación celular de larga duración, los tejidos, la transformación oncogénica, o células de amplificación de tránsito.

Detección por inmunofluorescencia de dos análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de Primaria

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.4K vistas.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos para cuantificar dos rondas sucesivas de la división celular. Esta estrategia es útil para detectar la renovación celular de larga duración, los tejidos, la transformación oncogénica, o células de amplificación de tránsito.

Video: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Investigación

Biología

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Mejora Técnica Swiss-laminación para la preparación del tejido intestinal para inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Inducción y detección de apoptosis en un cultivo primario de células intestinales de pepino marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Detección simple de cilios primarios por inmunofluorescencia

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...