The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

NOTA: Todos los procedimientos con animales vivos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva de la CE 86/609 / CEE directrices sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobado por el comité de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. inyección intraperitoneal de la timidina análogos <ol><li> Pesar los animales el día antes de la inyección. Calcular la cantidad de análogo de timidina requerido para todas las inyecciones previstas en el día siguiente, así como los volúmenes de inyección en función del peso individuales de una solución madre de 10 mg / ml. </li><li> Preparar 10 mg / ml solución timidina valores. (NOTA: Los análogos de timidina son tóxicos. Siga las hojas de seguridad específicas (MSDS) proporcionadas por los proveedores, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química). <ol><li> Tome análogo de la timidina del congelador y llevarlo a RT, aprox. 21 ° C. Pesar 10 mg y añadirsolución salina estéril (para BrdU y CldU) o 0,04 N NaOH (en solución salina estéril; para IDU), vórtice. Durante, por lo menos 10 - 15 minutos en un baño de agua a 50 ° C y agitar cada 2 - 3 minutos para disolver el polvo. NOTA: Utilice las soluciones para un máximo de 24 horas cuando se almacena a temperatura ambiente y durante varias semanas a -20 ° C. Proteja las soluciones de la luz (cubierta con papel de aluminio). Siempre verifique precipitados y volver a disolver si es necesario. </li></ol></li><li> Restringir el ratón por la piel y por vía intraperitoneal inyectar un volumen apropiado, ajustada al peso de la solución madre (a temperatura ambiente) con una jeringa de dosificación fina con una aguja de 30 G. NOTA: En caso de CldU e IDU tienen que ser administrados secuencialmente en el mismo animal, consideran para inyectar concentraciones equimolares (por ejemplo, 42,5 mg / kg CldU y 57,5 mg / kg IdU, que corresponden a 50 mg / kg de BrdU). Por lo tanto, ajustar los volúmenes de inyección de las soluciones de 10 mg / ml de solución madre en consecuencia. </li></ol> 2. Preparación del tejido <ol><li> Prepare formaldehído al 4% en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4 en el día antes de la perfusión. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Transcardially perfundir los ratones profundamente anestesiados (3,5% de isoflurano) a través del ventrículo izquierdo con PBS 10 ml de hielo-frío, luego con 40 ml de formaldehído enfriada con hielo (tasa de flujo de 5 ml / min). Diseccionar el cerebro y post-fix en el mismo fijador durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Transferir los cerebros consecutivamente en 10% (24 horas a 4 ° C) y 30% de sacarosa (hasta que los sumideros cerebrales, aprox. 48 h). Para la congelación, sumergir lentamente los cerebros crioprotegidas en -25 ° C hasta que no queden burbujas de isopentano emergen del tejido. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Los cortes de secciones coronales de 40 m de espesor en un micrótomo de congelación (temperatura del bloque a -25 hasta -16 ° C). Secciones de transferencia secuencialmente en solución anticongelante que contiene los pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (véase la Figura 1). Almacenar a -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Esquema de transferencia de rebanadas de microtomo en una placa de 24 pocillos. Comienza en A1 y ​​colocar rodajas posteriores en la fila A, después A6 ir a la siguiente fila B y así sucesivamente. Al llegar a D6, volver a A1 y continuar. Esta disposición de las rebanadas permite para la cuantificación de cada n-ésima sección de todo un cerebro. Para la cuantificación de células recién nacidas tomar cada 6 th sección cerebro (equivalente al contenido de una columna), por el fenotipo de inmunofluorescencia tomar cada sección 12ª (equivalente al contenido de 2 filas alternas de una columna). 3. La inmunotinción NOTA: Las secciones se procesan de flotación libre, generalmente en placas de 6 pocillos equipadas con placa de apoyo e inserciones de malla. Como excepción, el bloqueo, las incubaciones de anticuerpos y la reacción ABC se hacen en 12 ó 24 pocillos sin inserciones de malla (de 0,5 a 1 ml por well es suficiente, en función del número de rebanadas que tienen que ser manchado). Durante estos pasos, transferir secciones con la ayuda de un pincel fino (enjuagar con cada nueva solución). Todas las incubaciones se realizan con agitación continua (max 150 rpm). <ol><li> La inmunohistoquímica (método ABC) <ol><li> Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar por completo el anticongelante. </li><li> Incubar durante 30 min en 1,5% de H 2 O 2 en TBS-T para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Preste atención a la formación de burbujas y volver a sumergirse secciones si fuera necesario. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Opcional: Mientras tanto precalentar un armario de calefacción y de 2 N HCl a 37 ° C. Incubar las secciones durante 30 min a 37 ° C en 2 N HCl para desnaturalizar el ADN. Gently secciones separadas con la ayuda de un pincel. </li><li> Opcional: Neutralizar secciones durante 10 minutos en 0,1 M de borato de pH del tampón8,5, RT. Durante la transferencia, limpie brevemente las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras HCl. Enjuague 2 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y para bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT. </li><li> Incubar en anticuerpo primario diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar en anticuerpo secundario biotinilado diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. Mientras tanto ... </li><li> Preparar complejo ABC según el protocolo del fabricante (1% A + B al 1% en TBS-T). Dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Incubar las secciones de reactivo AB durante 1 hora a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Preparar 50 ml 0.5 mg / ml DAB en TBS-T por 6 ó 12 pocillos placa, dividido en dos mitades y pipetas 4 ml o 2 ml por pocillo, respectivamente. Secciones de transferencia en solución DAB (PRECAUCIÓN! DAB es tóxico. Siga el específic MSDS proporcionados por el proveedor, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química). </li><li> Añadir 0,5 ml 1% H 2 O 2 a la solución DAB 25 ml restantes, mezclar y volúmenes de pipeta equivalentes como anteriormente a cada pocillo para iniciar la reacción de la peroxidasa. Incubar durante 12 min. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje permanente. </li><li> Opcional: Contratinción antes de colocar el cubreobjetos (ver sección 3.5). NOTA: Si la relación señal-ruido es bajo debido a la alta fondo, repita H 2 O 2 de tratamiento después de la incubación con AB reactivo (paso 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-inmunofluorescencia <ol><li> Individual o simultánea inmunofluorescencia múltiple <ol><li> Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar completamente unanticongelante. </li><li> Opcional: que en los pasos 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT. </li><li> Incubar en cóctel primaria de anticuerpos (por ejemplo, α-BrdU rata, cobaya α-DCX, cabra α-GFP) diluidas en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Incubar en cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (por ejemplo, Rodamina Red α-rata, Alexa-647 α-cobaya, Alexa-488 α-cabra, todo derivado en burro) diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. </li><li> Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje acuoso. </li></ol></li><li> Inmunofluorescencia múltiple secuencial con anticuerpos primarios de misma especie hospedadora <ol><li> Como pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incubar en fiprimer anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno A), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en primer anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Rodamina Red-conj. Burro α-conejo), 3 horas RT. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en 10% de suero normal de mismo host que los anticuerpos primarios (por ejemplo, suero de conejo) para RT 3 horas para saturar paratopos abiertas en el primer anticuerpo secundario. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en TBSplus con 50 g / ml fragmentos Fab monovalentes no conjugado dirigido contra el anfitrión de los anticuerpos primarios (por ejemplo, α-conejo IgG (H + L)) para cubrir epítopos que podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario, O / N en 4 ° C. </li><li> Enjuague al menos 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 min cada uno. Durante la transferencia, la SWA brevementeb las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras Fab. </li><li> Incubar en segundo anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno B), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en segundo anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Alexa-488-conj. Burro α-conejo), 3 hr RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente. NOTA: Para etiquetar antígenos con anticuerpos de diferentes especies huésped que añadir al paso 3.2.2.2 y los respectivos anticuerpos secundarios al paso 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Uno de los anticuerpos secundarios a partir de una misma especie como uno de los anticuerpos primarios NOTA: Este protocolo es adecuado para cuádruple tinción contra BrdU o Ki67 junto con GFAP, nestin-GFP y DCX. <ol><li> Siga estrictamente el protocolo pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Hasta este punto, utilizar sólo suero burro en TBSplus. </li><li> Incubar en TBSplus que contiene 3% de suero de cabra durante 1 hora a RT. Esto cubre paratopos abiertas en el anticuerpo secundario-α de cabra. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en AMCA-conj. cabra α-conejo diluido en TBSplus, RT 3 hr o O / N 4 ° C. Enjuague tres veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente. </li></ol></li><li> CldU, IdU co-tinción <ol><li> Enjuague, desnaturaliza y neutralizar secciones como se describe en la sección 3.2.1 (pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incubar con 20 g / ml fragmentos Fab no conjugados α-ratón IgG (H + L) en TBSplus, 1 hr a RT. Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en cóctel de anticuerpos primario que contiene α-BrdU de rata (1: 400; purificado IgG2) y α-BrdU de ratón (1: 350) diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en cóctel de anticuerpo secundario que contiene burro biotinilados α-rata (1: 500) y FITC-conj. burro α-ratón fragmentos Fab (1: 100). Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar en Rodamina Red-conj. Estreptavidina, 2 horas a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente. </li></ol></li><li> La amplificación de señal de fluorescencia en ratones nestin-GFP <ol><li> Añadir cabra α-GFP al cóctel de anticuerpo primario. </li><li> Añadir un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo con propiedades espectrales similares a GFP (como Alexa 488 conj. Burro α-cabra) al cóctel de anticuerpo secundario. </li></ol></li></ol></li><li> Recuperación del epítopo <ol><li> Llevar a cabo la recuperación de epítopo después de aclarar el anticongelante. Precalentar el vapor con 6 ó 12 pocillos que contenían tampón 0,1 M de citrato de pH de 6,0 a 95 a 99 ° C (aproximadamente 25 min). </li><li> Transferir las secciones en el tampón de citrato caliente y vapor durante 30 minutos (cubrir las placas con papel de aluminio como el plástico lIDs no se calientan-resistente). </li><li> Inmediatamente colocar las placas en un baño de hielo para refrescarse. Esto ayuda a proteger la morfología del tejido, lo cual es de particular importancia cuando se trabaja con secciones de cerebro de animales postnatales. </li><li> Enjuagar 3 veces en TBS durante 10 minutos cada uno para enjuagar y neutralizar el citrato y continuar tinción. </li></ol></li><li> Ratón anticuerpos en tejido de ratón <ol><li> Añadir 20 g / ml fragmentos Fab monovalentes α-ratón IgG (H + L; mismo host-especies que anticuerpo secundario) para la primera etapa de bloqueo (por ejemplo, paso 3.1.5 o 3.2.1.3). </li><li> Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno, y proceda con el protocolo respectivo. </li></ol></li><li> Cresil violeta counterstaining <ol><li> Solución de Precalienta cresil violeta a 60 ° C (en frasco de vidrio). Incubar los portaobjetos en la solución caliente durante 3 minutos. </li><li> Enjuague en ac. dest. y deshidratar 2 veces durante 1 min cada uno en 70%, 96% y 100% de isopropanol. </li&gt; <li> Borrar para 5 - 6 min en xileno o un sustituto de xileno y el cubreobjetos con un medio de montaje permanente compatible. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Contar las células recién nacidos peroxidasa teñidas en cada sección 6º a lo largo de toda la extensión rostrocaudal del giro dentado. Utilice un microscopio de luz con un aumento de 400X. </li><li> Multiplicar el número de células resultantes con el intervalo de intersección para obtener una estimación del número total de células recién nacidos. </li><li> Imagen de la fluorescencia etiquetada secciones con un microscopio láser confocal equipado con láseres y sistemas de filtros adecuados. Tome pilas de imágenes en posiciones aleatorias a lo largo de toda la extensión de la circunvolución dentada con una ampliación de 400X y analizar al menos 50 celdas seleccionadas al azar de interés por hemisferio para co-etiquetado con otros marcadores. </li><li> Multiplique los porcentajes resultantes de las células co-etiquetado (% / 100) con el número total de células recién nacidas para calcular absolutanúmero de poblaciones específicas de células recién nacidas. </li></ol>

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus.">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li><li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain.">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li><li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning?+evidence+from+animal+research.">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li><li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li><li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus.">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li><li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li><li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination.">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li><li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+protein:+the+immaculate+deception.">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice.">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment.">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis.">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li><li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2.">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46 (2012).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li><li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry:+a+concise+review+with+practical+considerations.">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La cuantificación e identificación de las subpoblaciones de células recién nacidas es un tema central en la investigación neurogénesis adulta. Combinando marcadores de proliferación y anticuerpos contra las proteínas expresadas durante etapas específicas de la neurogénesis adulta permite la detección inmunohistoquímica de estas subpoblaciones. Algunos de los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos requieren condiciones de tinción específicas. Etiquetado de células que se di...

Dos regiones del cerebro generar nuevas neuronas constitutivamente largo de la vida, la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo (DG). Las neuronas recién nacidas se derivan de las células progenitoras neurales y pasan por diferentes etapas de desarrollo morfológico y fisiológico antes de alcanzar la madurez 1,2. Desde un dividiendo lentamente-glía radial como células madre (tipo 1) etapas consecutivas de tránsito amplificar surgen células progenitoras intermedias. Los subtipos más indiferenciados (tipo 2a y 2b tipo) tienen una forma irregular con cortos, procesos tangenciales. Generan neuroblastos (tipo 3) que salen gradualmente del ciclo celular para convertirse en neuronas inmaduras (con dendritas extienden hacia la capa molecular) y finalmente integrar en la red del hipocampo células granulares como maduros. Debido a sus características fisiológicas estas células proporcionan los circuitos con una mejora de la plasticidad 3 sugeting un papel único en la función del hipocampo. En realidad, los estudios de la última década generado evidencia sustancial de que la neurogénesis adulta contribuye a la memoria espacial, la separación patrón de comportamiento emocional y 4,5. Neurogénesis adulta se puede estudiar utilizando diferentes enfoques. Análogos de timidina incorporan en el ADN durante la fase S del ciclo celular y permiten nacimiento de citas, la cuantificación y el destino análisis de las células recién nacidos 6-8. La aplicación secuencial de los diferentes análogos de timidina (por ejemplo, CldU, EdU o IDU) puede ser usado para estudiar la renovación celular o poblaciones de células nacidos en diferentes puntos de tiempo durante el curso de un experimento 9. Una alternativa, marcador endógeno para la proliferación celular es Ki67. Se expresa en las células en división durante todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2, M) excepto la fase de reposo (G0) y el comienzo de G1 10,11. Para analizar el fenotipo de las poblaciones de células recién nacidas en el adulto dentate gyrus varios marcadores moleculares específicos de la etapa se pueden utilizar como GFAP, nestina, DCX y NeuN 1,6. GFAP es un marcador de astrocitos maduros pero también se expresa en células gliales-como radiales en el cerebro anterior adulto. Nestin es un filamento intermedio específico para células gliales como radiales y células progenitoras intermedios tempranos. DCX es una proteína asociada a microtúbulos expresado en progenitores intermedios, los neuroblastos y las neuronas inmaduras. Sobre la base de la (co) expresión de estos tres marcadores y las características morfológicas de las células marcadas cuatro subtipos de células progenitoras se pueden identificar diferentes: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestina + , DCX -), el tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) y tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etiquetado de DCX junto con NeuN, que se expresa en las neuronas postmitóticas, permite la diferenciación de immature (DCX +, NeuN +) y maduros (DCX -, NeuN +) neuronas granulares. Los marcadores mencionados anteriormente se utilizan con frecuencia para inmunofluorescencia co-etiquetado y microscopía confocal posterior para analizar el número y la identidad de las células recién nacidos. Esto requiere típicamente anticuerpos de diferentes especies huésped para evitar anticuerpo no deseado reactividad cruzada. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos primarios adecuados para la investigación neurogénesis resucitan ya sea en conejos o ratones (por ejemplo, ratón α-BrdU, ratón α-NeuN, conejo α-Ki67, conejo α-GFAP). Esto conduce a graves limitaciones en el número y la combinación de antígenos que se pudieron evaluar en una sola porción. Esto a su vez no sólo aumenta el esfuerzo de tinción, como múltiples coloraciones tienen que ser realizadas, pero también podría comprometer la fiabilidad de los resultados. Además, algunos antígenos son susceptibles a la formalina enmascaramiento epítopo inducida por la fijación (por ejemplo, Ki67, Nestina). Esta revisión se describen las modificaciones de los protocolos immunolabeling múltiple y simple clásicos (por ejemplo, la recuperación de epítopo, inmunotinción secuencial múltiple, uso de nestin-GFP ratones transgénicos 12) que superar muchas de estas cuestiones. En particular, el protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple permite tinción contra un máximo de cuatro antígenos diferentes, incluso si una parte de los anticuerpos se deriva de la misma máquina. Esto permite la detección simultánea de tipo 1, tipo 2a, tipo 2b y tipo de células progenitoras 3, así como su actividad proliferativa dentro de una sola sección.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

Neurogénesis adulta es un proceso multi-etapa altamente regulado en el que las nuevas neuronas se generan a partir de una célula madre neural activado a través de cada vez más comprometida subtipos progenitoras intermedias. Cada uno de estos subtipos expresa un conjunto de marcadores moleculares específicos que, junto con los criterios morfológicos específicos, pueden ser utilizados para su identificación. Por lo general, las técnicas de inmunofluorescencia se aplican implica anticuerpos específicos de subtipo en combinación con marcadores de proliferación exo o endógenos. Nosotros describimos en la presente memoria métodos para la detección y cuantificación de todas las etapas de neurogénesis en el hipocampo adulto immunolabeling. Estos comprenden la aplicación de los análogos de timidina, perfusión transcardial, procesamiento de tejido, de recuperación de epítopo inducida por calor, ABC de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta múltiple, microscopía confocal y cuantificación de células. Además se presenta un protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple que evita problemas usually que surge de la necesidad de la utilización de anticuerpos primarios planteados en la misma especie hospedadora. Se permite una identificación precisa de todos los subtipos progenitoras del hipocampo, junto con un marcador de proliferación dentro de una sola sección. Estas técnicas son una poderosa herramienta para estudiar la regulación de los diferentes subtipos progenitoras en paralelo, su implicación en patologías cerebrales y su papel en las funciones específicas del cerebro.

Se aplicaron los métodos descritos anteriormente para cuantificar y caracterizar las células recién nacidas en el hipocampo postnatal y adulto. Por lo tanto, hemos utilizado de tipo salvaje y la neurogénesis deficiente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 ratones alojados en condiciones conocidas por afectar la tasa de neurogénesis (es decir, el medio ambiente enriquecido, EE) 13,14. Tinción inmunohistoquímica DAB contra cualquiera de Ki67, BrdU, CldU o IdU reveló consistentemente diferen...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis at JoVE.com

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K vistas.  Jena University Hospital. This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Video: Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Investigación

Neurociencias

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Puñalada de Lesiones de la herida del pez cebra Telencéfalo adultos: un método para investigar Vertebrados Cerebro neurogénesis y Regeneración

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La neurogénesis en la evaluación primaria<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones Usando Inmunoticción

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.