Este protocolo permite la detección rápida y fácil de cilios primarios en células cultivadas, dentro de una variedad de esfuerzos de investigación. El método podría ser utilizado en el trastorno que afecta a los cuerpos basales de los cilios primarios. Este procedimiento también se puede aplicar para la tinción de cilios primarios en tejido incrustado de parafina o para otros experimentos donde se necesita fluorescencia.
Comience por autoclaving 22 por 22 milímetros de cubierta, y la preparación de materiales para el experimento. Descongelar FBS y penicilina estreptomicina, y calentar el cultivo de temperatura media a ambiente. Pasaje de las células con trippsina EDTA y PBS.
Preparar 4%paraformaldehído fresco, medio de cultivo y solución de gelatina al 1%, según las instrucciones del manuscrito. A continuación, limpie la campana de flujo laminar con 70% de etanol y coloque todos los materiales necesarios en el interior. El paraformaldehído es extremadamente peligroso.
El EPP adecuado tiene que ser usado en todo momento, y sólo debe ser manejado en una capucha química. Después de cultivar las células deseadas al 70%confluencia, retírelas de la incubadora y colóquelas en la campana de flujo laminar. Retire el medio de cultivo y enjuague las células dos veces con PBS.
Añadir alrededor de dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA al matraz de cultivo, e incubarlo a 37 grados Centígrados durante cinco minutos. Revise las células periódicamente en el microscopio invertido para monitorear el desprendimiento. Cuando las células se han separado suavemente las resuspend en 10 mililitros de medio de cultivo, pipeteando cuidadosamente para crear una sola suspensión de celda.
Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifúquela a 200 veces G'for cinco minutos. Decantar el sobrenadante luego añadir 10 mililitros de medio de cultivo, y resuspender suavemente el pellet. Tome 20 microlitros de la suspensión celular y mezcle con el azul de tripano en una relación de volumen uno a uno.
A continuación, cuente las células utilizando hemocitometría estándar. Coloque un resbalón de cubierta dentro de cada pozo de una placa de seis pozos, y cubra el resbalón de la cubierta con dos mililitros de la solución de gelatina, lo que ayudará a que las células unidas a la cubierta se resbalen. Retire la gelatina y deje que la placa se seque al aire durante unos minutos.
Semillas 100.000 fibroblastos en cada pozo y añadir dos mililitros de medio de cultivo. Luego incubar las células durante 24 horas a 37 grados Centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono y 90% de humedad relativa. Después de la incubación tratar las células para inducir la ciliación.
Caliente el 4%paraformaldehído a temperatura ambiente, y prepare una pipeta de pastos, ABS, un contenedor de residuos, tubos cónicos de 15 mililitros, micro pipetas y puntas. Tome las células de la incubadora y colóquelas en el banco del laboratorio. Retire los medios de cada pozo, dejando el resbalón de la cubierta.
Lave suavemente las células tres veces con dos mililitros de PBS. Luego agregue dos mililitros del 4%PFA en cada pozo para fijar las celdas. Incubar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego retirar el PFA y repetir los lavados con PBS.
Añadir dos mililitros de 0.5%Tritón X-100 a cada pozo, e incubar la placa durante 15 minutos. A continuación, lave los pozos cuatro veces con PBS. Para hacer la solución de bloqueo, descongele un suero de cabra durante cinco minutos y diluya en PBS en una proporción de uno a 20.
Añadir 150 microlitros de esta solución a cada resbalón de cubierta e incubar la placa durante 20 minutos. Descongelar los anticuerpos primarios durante cinco minutos, y diluirlos por separado en PBS, como se describe en el manuscrito de texto. Retire la solución de bloqueo de los resbalones de la cubierta y añada 150 microlitros de ambas soluciones de anticuerpos.
A continuación, incubar la placa durante 60 minutos a temperatura ambiente. Retire los anticuerpos primarios y lave suavemente los resbalones de la cubierta tres veces con dos mililitros de PBS. Diluir Cy3 Sheep Anti-Mouse y Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit en PBS, a una proporción de uno a 300, y añadir 150 microlitros de ambas soluciones de anticuerpos secundarios al resbalón de la cubierta.
Preparar una solución DAPI en funcionamiento diluyendo 10 microlitros del stock en 50 mililitros de PBS, y añadir dos mililitros de esta dilución a los resbalones de la cubierta. Incubar el plato durante cinco minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. Antes de colocar los resbalones de la cubierta en los portaobjetos, prepare dos agujas, pinzas y medios de montaje, y etiquete todas las diapositivas.
Retire la solución DAPI de los pozos y lávela tres veces con PBS. Coloque una gota de medios de montaje en cada diapositiva. Utilice la aguja para levantar suavemente el resbalón de la cubierta desde la parte inferior del pozo.
A continuación, voltéelo y colóquelo suavemente sobre la gota de los medios de montaje con las pinzas. Retire con cuidado las burbujas. Proteja los portaobjetos de la luz y guárdelos durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente utilice un microscopio fluorescente o confocal con un alto aumento para visualizar a los cilios primarios. Este protocolo se utilizó para fijar inmunosu mancha, e imágenes de varias líneas celulares que expresan cilios primarios. Cuando los mioblastos de ratón fueron expuestos a la radiación ionizante a varias dosis, se encontró que dosis más altas inducen la aparición de múltiples cilios primarios.
Mientras que dosis bajas resultaron en la aparición de cilios primarios individuales. Del mismo modo, cuando los fibroblastos pulmonares humanos se irradiaban a una dosis baja, los cilios primarios únicos se detectaron por inmunofluorescencia. Se observó un aumento de los cilios primarios en fibroblastos embrionarios de ratón que murieron de hambre, lo que demuestra que el estrés metabólico afecta a los incidentes de los cilios primarios.
Cuando los fibroblastos cutáneos fueron tratados con 120 doxorubicina nanomolares, expresaron un único cilium primario. Dosis más altas inducen la aparición de múltiples cilios primarios. Los fibroblastos tratados con 1,25 Taxol nanomolar también expresaron un único cilium primario.
Pero no se detectaron varios cilios después del tratamiento con dosis más altas. Al abrir este protocolo, asegúrese de seguir todas las regulaciones de EPI. Tenga en cuenta las necesidades de cultivo de su línea celular de elección y elija sus anticuerpos cuidadosamente.
Este procedimiento no puede ser seguido directamente por otros procedimientos, ya que las células son irrecuperables. En su lugar, deben programarse experimentos paralelos.
