Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH DE018304, R01DE018281. KT es compatible con T32 GM07092-34 y por una beca de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill de Instituto Médico Howard Hughes (HHMI), a través del Mediterráneo en Grad Iniciativa. PC es compatible con T32 CA009156.

El qPCR pre-miRNA matrices de perfiles se pueden configurar como totalmente automatizada con un robot Tecan Libertad Evo (A) oa mano con la pipeta multicanal electrónica Matrix (B). 1) Prepare la mezcla maestra, placas de imprimación y muestras. <ol><li> Primer placas que contienen 186 pares de cebadores en formato de 96 pocillos (un total de 2 placas) en 24:05 deben ser almacenados a -80 ° C. Placas de descongelar a temperatura ambiente, mezclar y centrifugar brevemente antes de su uso. </li><li> Para preparar la mezcla maestra, descongele SYBR Green 2x Mix PCR a temperatura ambiente. Cada reacción utiliza mezcla maestra 8ul con imprimación 2UL. La composición de la mezcla maestra por la reacción es la mezcla SYBR 4ul, 3UL agua grado PCR y 10-20 ng de ADN de muestras o de ADNc. </li><li> Para la configuración manual de cada placa de 96 pozos, cuatro tubos de mezcla maestra se necesita. Las muestras se pueden ejecutar cuatro muestras por placa (singlicate), 2 muestras por placa (duplicado) o una sola muestra por cuadruplicado. </li><li> Prepare la mezcla de maestro mediante la combinación de SYBR, el agua y la muestra en cada uno de 4 tubos Eppendorf de 2 ml. Cada tubo debe contener mezcla maestra suficiente para unas 100 reacciones, permitiendo que el exceso de residuos que permitan tomar. Vortex para mezclar. </li></ol> A. La instalación de ensayo de pre-miRNA con la libertad Tecan Evo robot. <ol><li> Después de la inicialización del robot y la carga del programa Evoware, enjuague tres veces con cada uno de 30ml para limpiar el sistema de burbujas de aire que puedan interferir con la precisión de pipeteo. </li><li> Configuración de la plataforma de robot para incluir lo siguiente: <ul><li> Etiquetado de 384 pocillos </li><li> Placa de 96 pocillos de imprimación (1) </li><li> Mezclas maestras </li><li> Una cubeta con 2% de lejía </li><li> Un sistema de recipiente lleno de líquido </li><li> Contenedor de basura vacío </li></ul></li><li> Comience ejecutar robot automatizado seleccionando la opción &quot;Ejecutar&quot; en dos ocasiones. </li><li> Al final del programa, quite la placa de 384 pocillos y sellado con una lámina de sellado LightCycler 480 y centrifugar brevemente. Lugar cerrado placa 384-y en la posición 1 del hotel. </li><li> Ir al paso 2.2 y repetir para la placa de imprimación con mezclas de dos maestros nuevos y una nueva placa de 384 pocillos. <ol><li> Coloque la placa de sellado en la posición 2 del hotel. </li></ol></li><li> Programa abierto nuevas Evoware para la carga de la LightCycler del hotel, y seleccione &quot;Ejecutar&quot; en dos ocasiones. <ol><li> Libertad Evo se cargará automáticamente cada plato en el LightCycler y ejecute el siguiente SYBR verde I / HRM programa de ciclismo: Pre (1 ciclo): 50 º durante 5 minutos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg 95 º durante 5 minutos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg Amp (45 ciclos): 95 º durante 15 segundos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg 62 ° durante 30 segundos a velocidad de rampa de 2,5 ° / seg (Adquisición de datos único en este paso) La curva de fusión: 95 º durante 5 segundos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg 60 º C durante 1 minuto a velocidad de rampa de 2,5 ° / seg 95 ° continua en rampa de 0,11 ° / seg con 5 ° C por adquisiciones Cool: 50 º C durante 30 segundos a velocidad de rampa de 25 ° / seg </li></ol></li></ol> B. La instalación de ensayo de pre-miRNA con la pipeta multicanal electrónica Matrix: <ol><li> Coloque el contenido del tubo de mezcla maestra 1 en un depósito. </li><li> Establecer la pipeta electrónica para aspirar 16ul de la mezcla principal con 2 8ul prescindir de los pasos seguidos por un paso de purga. </li><li> Para un maestro de la mezcla, distribuir 8ul en todos los otros y de la placa de 384 pocillos (establecido en 384-y espaciamiento de punta), empezando por el pocillo A1. (Es decir, los pozos A1, C1, E1, etc) Para el segundo 8ul prescindir, pasar a la columna 3 (es decir, pozos A3, C3, E3, etc) luego se purgan en un contenedor de residuos y consejos para eliminar. </li><li> Siguen este patrón para el resto de 5 ciclos hasta llegar así A23. </li><li> Repita el procedimiento para la mezcla principal 2, (a partir y A2, C2, E2, etc), Mix Master 3 (a partir de B1 así, D1, F1, etc); Master Mix 4 (a partir de B2, D2, F2, etc .). </li><li> Para aliquotting de la placa de imprimación, establezca pipeta electrónica para aspirar y dispensar 2UL 2UL con un siguiente paso de purga. Prescindir 2UL de cebadores de la columna 1 de 96 y placa de imprimación (AH) en la placa de 384 pozos, pozos A1, C1, E1, etc purga en un contenedor de residuos y consejos para eliminar. Repita la operación para pozos A2, C2, E2, B1, D1, F1, y B2, D2, F2, etc </li><li> Repetir las filas 2-12 de cebadores de 96 pozos, pasando por cada 2 columnas para cada columna de imprimación, hasta que en 384 y placa ha sido alícuotas. </li><li> Placas de sellado con una lámina de sellado LightCycler y centrifugar brevemente. </li><li> Coloque las placas en un LightCycler 480 y el ciclo de las placas de acuerdo con los siguientes valores con el SYBR Green I / formato de gestión de recursos humanos de detección: Pre (1 ciclo): 50 º durante 5 minutos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg 95 º durante 5 minutos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg Amp (45 ciclos): 95 º durante 15 segundos a velocidad de rampade 4,8 ° / seg 62 ° durante 30 segundos a velocidad de rampa de 2,5 ° / seg (Adquisición de datos único en este paso) La curva de fusión: 95 º durante 5 segundos a velocidad de rampa de 4,8 ° / seg 60 º C durante 1 minuto a velocidad de rampa de 2,5 ° / seg 95 ° continua en rampa de 0,11 ° / seg con 5 ° C por adquisiciones Cool: 50 º C durante 30 segundos a velocidad de rampa de 25 ° / seg </li><li> Repita con la placa de cebador 2, aliquotting en un plato fresco de 384 pozos con mezcla recién preparada maestro. </li></ol> Secretos para el éxito: Una característica importante en el diseño de matrices de la PCR es que los 186 pares de iniciadores tienen la misma temperatura de recocido, por lo que la placa se puede ejecutar en la misma configuración óptima PCR programa que se ejecuta. Cada nueva matriz se debe comprobar con tres controles antes de la ejecución de ejemplos. Estos controles son los siguientes: Un plazo de todos los primers funcionar con agua o 0,1 x TE descartar la contaminación de imprimación. Un plazo de alternar el agua / TE y el control positivo, para garantizar que no arrastre. 3 funciona con el control positivo mismo, para asegurar la reproducibilidad entre carreras. Mezclas maestro debe prepararse, y las placas se debe ejecutar dentro de las 24 horas para obtener resultados óptimos Primer papel de la placa debe ser retirado lentamente para reducir el riesgo de contaminación entre los pocillos. Cuando se utiliza un robot con puntas fijas, 2% lavado de cloro es necesario lavar las puntas de cada paso de pipeteo, seguida de un chorro de agua. Esto previene y elimina la prórroga, lo cual podría contaminar los datos y dar lugar a resultados no concluyentes. Después de un plato que se ejecuta a través de la LightCycler, que no debe abrirse de nuevo en la sala de configuración de PCR. Esto ayuda a evitar la contaminación de PCR. Los resultados representativos: qPCR resultados son por lo general representado por los valores CT determinado por el software de análisis LightCycler. Una carrera exitosa por lo general consiste de una serie de TC de las muestras, por lo general entre 20 a 35 para las muestras que son positivas. Las muestras de agua en una buena racha siempre están en una tomografía computarizada de&gt; 40 y las muestras o los pozos específicos con un TC más de 37 se consideran negativas o no detectados. Como regla general, las muestras de ceder un CT de &lt;10 tampoco son fiables y están excluidos del análisis. Hay varias maneras de analizar los datos qPCR y la inclusión de los controles internos en nuestro ensayo ayuda a controlar la variación de la entrada de la muestra. La matriz pre-MIR incluye un manual de control de U6, que se utiliza a menudo como un gen de referencia para normalizar los valores de CT a partir de muestras diferentes. Este valor normalizado que se conoce como el valor delta CT (DCT). Los resultados suelen representarse como la materia prima CT, el valor de DCT o pueden ser analizados con los valores estandarizados. En la Figura 1, el análisis de la totalidad de pre-microARN serie de cuatro muestras diferentes de un experimento timecourse se presenta en formato de mapa de calor. La expresión relativa de cada uno de microARN pre-que se muestra y surgieron tres grupos principales, distintas. La mayoría de los pre-MIR analizado experimentó cambios pequeños, insignificantes como se esperaba (Figura 1). Sin embargo, una pequeña parte de la pre-micro ARN se redujo significativamente (fig. 1B) o aumentado de manera espectacular (Figura 1 C) durante todo el experimento timecourse. Los niveles de expresión de microARN cada pre-se normalizaron con el punto de tiempo 0 h (muestra 1) como nivel de referencia. En algunos casos, es posible que tenga en cuenta que algunos de los pre-agrupados microARN también se agrupan en el análisis de mapa de calor (por ejemplo: let-7a, fig. 1B). Dependiendo del experimento, los grupos pueden surgir que dependen de la infección viral, la expresión de tipo de células específicas de pre-micro ARN o pre-MIR que están regulados por una molécula común o vía de señalización. El ensayo previo de micro ARN que se han desarrollado también incluye una serie de conocidos viral antes de los microARN y los genes codificados por el sarcoma de Kaposi asociado herpes (HVSK) y virus de Epstein Barr (EBV), además de los humanos pre-MIR. Estos pueden ser usados ​​como controles positivos o negativos, dependiendo de la línea celular y el estado viral de las muestras utilizadas. En la figura 2, los transformadores de intensidad media de una muestra de HVSK negativo ejecutar en cuatro se muestran. Es importante destacar que, HVSK LANA no se detectó en esta muestra por la matriz qPCR de alta sensibilidad. Sin embargo, U6 - nuestro control interno y dejar 7a - una alta expresión humana pre-microARN, se expresaron en niveles detectables. Finalmente, como se esperaba, el control negativo de PCR de calidad del agua no resulta un producto qPCR. Otro indicador de una carrera exitosa qPCR es un análisis de la curva de fusión bien, lo que puede dar una idea de la posible contaminación en las muestras. Para establecer una temperatura de fusión, la placa se calienta lentamente después de la PCR se ha completado. Como las hebras de ADN separados, SYBR verde se libera, y disminuye la señal de fluorescencia. La temperatura a la que este proyecto de resoluciónop se produce la representación gráfica, y es conocida como la temperatura de fusión de la muestra. Dependiendo de la secuencia de ADN, las muestras se funden a temperaturas diferentes el uno del otro y del control negativo de agua, que no debe tener una temperatura de fusión del ADN, ya que no está presente. Los productos de PCR de cada par de cebadores que se funden a temperaturas similares. Por ejemplo, la Figura 3 se muestra un análisis de la curva de fusión de dos cebadores diferentes utilizando la misma muestra por duplicado. Está claro que la temperatura de fusión es diferente para los dos pares de primers, pero la muestra se está derritiendo a la misma temperatura exacta para cada réplica. Los signos de una muestra de mala o potencialmente contaminado puede incluir varios picos de fusión, lo que sugiere la presencia de dos diferentes fuentes de entrada. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. MicroARN Pre-emergen a través de perfiles de las firmas con un qPCR basada en la novela matriz. El promedio se calculó deltaCTU6 y valores normalizados fueron cargados en el software ArrayMinerTM, produciendo tres grupos distintos se muestra como mapas de calor. (A) Pre-microARN con pequeños cambios en la expresión se muestran. Pre-microARN cuyos niveles se redujeron significativamente (B) o mayor (C) también se muestran. Azul corresponde a los niveles más bajos de expresión mientras que el rojo representa el aumento de los niveles de expresión. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Inclusión de los controles internos en la qPCR basado en pre-microARN matriz. La prima valores CT para 3 genes diferentes y un control de plantilla no se muestran. U6 se utiliza como un control positivo interno, mientras que la PCR H2O nos sirve como control negativo. Vamos-7a-1-1 es un microARN normalmente se expresa en muchos tipos celulares diferentes, mientras que HVSK LANA se puede utilizar como un control positivo o negativo, según el estado viral de la línea de células o tejidos utilizados. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fusión análisis de los picos de los cebadores pre-microARN y la falta de contaminación de la muestra. Las curvas de fusión se obtuvieron mediante el análisis de llamadas Tm en el software LightCycler. Dos cebadores diferentes (Primer A y B) para la misma muestra por duplicado se muestran. La temperatura de fusión de cada cebador es distinto. Sin embargo, la muestra tiene un solo pico, lo que demuestra la falta de contaminación de la muestra.

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

QPCR es un ensayo muy sensible que puede ser utilizado para comparar los niveles de expresión genética entre las muestras en un estudio, así como para determinar la positividad en el caso de los virus. La ventaja de utilizar matrices de qPCR es la capacidad de ejecutar muchos primers (en nuestro caso, 186 pares de cebadores) para cada muestra en un corto período de tiempo. El uso de un robot de pipeteado como el Evo Tecan la libertad, la cantidad de tiempo necesario para establecer un experimento hasta pueden reduci...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

Cuantitativa en tiempo real PCR (QPCR) se ha convertido en una herramienta precisa y valiosa en los perfiles de los niveles de expresión génica. Una de sus muchas ventajas es un menor límite de detección en comparación con otros métodos de perfiles de expresión génica durante el uso de pequeñas cantidades de entrada para cada ensayo. Automatizado de configuración qPCR ha mejorado este campo, al permitir una mayor reproducibilidad. Su configuración permite una rápida y conveniente para experimentos de alto rendimiento, lo que permite determinar las características de muchos genes diferentes al mismo tiempo en cada experimento. Este método junto con los controles internos de la placa también reduce las variables experimentales comunes a otras técnicas. Recientemente hemos desarrollado un ensayo qPCR para la elaboración de perfiles de pre-microRNAs (pre-miRNAs) usando un conjunto de 186 pares de cebadores. Los microARNs se han convertido en una nueva clase de pequeños ARN no codificantes con la capacidad de regular muchas de las metas de mRNA en el nivel post-transcripcional. Estos ARN pequeños se transcribe primero por la ARN polimerasa II como un miRNA primaria (pri-miRNA) transcripción, que se escinde en el miARN precursor (pre-miRNA). Pre-miRNAs se exportan al citoplasma, donde Dicer corta la horquilla para producir miRNAs maduros. Los aumentos en los niveles de miRNA se puede observar tanto en el precursor y los niveles de miRNA maduros y el perfil de estas dos formas pueden ser útiles. Hay varias pruebas disponibles en el mercado de miRNAs maduros, sin embargo, su alto costo puede disuadir a los investigadores de esta técnica de perfiles. En este caso, hablamos de un costo-efectiva, confiable, basado en el método SYBR qPCR de los perfiles pre-miRNAs. Cambios en los niveles pre-miRNA maduros suelen reflejar los cambios miRNA y puede ser un indicador útil de la expresión de miRNA maduros. Sin embargo, el perfil simultánea de ambos pre-miRNAs y miRNAs maduros puede ser óptimo, ya que pueden aportar información redundante y proporcionar información sobre el procesamiento de microARN. Además, la técnica descrita aquí se puede ampliar para abarcar la elaboración de perfiles de grupos de otras bibliotecas de vías específicas o patógenos.

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K vistas.  University of North Carolina at Chapel Hill. Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Video: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Investigación

Biología

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoreo en tiempo real de la activación de aurora quinasa A utilizando biosensores FRET conformacionales en células vivas

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...