Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunidad pulmonar sobre cómo evaluar la expresión de microRNAs que se predicen para regular los genes inflamatorios dentro del pulmón. Esta técnica ofrece la forma sencilla de identificar las contribuciones de las hormonas circulantes a la expresión del microARN pulmonar. Para evaluar la etapa del ciclo estroso, sujeta manualmente un ratón hembra de ocho a nueve semanas de edad e introduce la punta de una pipeta de plástico de 10 microlitrotro llena de agua ultra pura en la vagina.
Enjuague suavemente de cuatro a cinco veces para recoger una muestra y deposite el rubor final del líquido vaginal en un portaobjetos de vidrio. A continuación, observe el color vaginal no manchado bajo un microscopio de luz con aumento de 20X. Para exposiciones de ozono y aire filtrado, coloque un máximo de cuatro ratones en uno de los dos recipientes individuales de vidrio de 1,2 litros con tapas de malla de alambre.
Coloque un recipiente de vidrio en una cámara de ozono y otro en una cámara de exposición de aire filtrada. A continuación, ajuste la concentración de ozono a dos partes por millón, retirando el recipiente después de tres horas. Cuatro horas después de la exposición, desinfectar la superficie de la piel expuesta del primer ratón experimental con 70%etanol y cortar la caja torácica para exponer el corazón y los pulmones.
Utilice fórceps para sumergir un tubo de micro centrífuga libre de RNase de 1,5 mililitros en el nitrógeno líquido, y congele el pulmón cosechado en el nitrógeno líquido. Luego usa un pulverizador de tejido de acero inoxidable para enmascarar todo el pulmón, y divide el tejido pulverizado entre dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después de cosechar y pulverizar los pulmones de todos los animales de esta misma manera, agregue 500 microlitros de tiocianato de guanidinio a cada muestra y homogeneice secuencialmente cada tejido con agujas de calibre 18, 21 y 23.
Después de la última homogeneización, añadir 500 microlitros de etanol a cada muestra antes de vórtice durante 15 segundos. Cargue las mezclas en columnas de espín individuales en tubos de recogida individuales para la centrifugación y deseche los flujos a través. Para el tratamiento con DNase 1, añada 400 microlitros de tampón de lavado de ARN a cada columna para otra centrifugación y mezcle cinco microlitros de DNase 1 y 75 microlitros de tampón de digestión de ADN por muestra en tubos libres de RNase.
Agregue la mezcla directamente a las matrices de columna para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, seguida de dos lavados de solución de prelavado de ARN de 400 microlitros por centrifugación. Para eluir el ARN, agregue 35 microlitros de agua libre de DNase RNase directamente a cada matriz de columna para una centrifugación final, y mida la concentración total de ARN y pureza de cada muestra en un espectrofotómetro. A continuación, almacene el ARN a menos 80 grados centígrados.
Para la retrocripción de RNase pequeña, agregue 200 nanogramos de ARN total en 10 microlitros de solución de prelavado a un tubo de mezcla de reacción de transcripción inversa por muestra. Después de mezclar, centrifuga brevemente las muestras y colóquelas sobre hielo hasta su incubación. A continuación, incubar los tubos durante 60 minutos a 37 grados centígrados, seguido de una incubación de cinco minutos a 95 grados centígrados.
Al final de la segunda incubación, diluir el CDNA con 200 microlitros de agua libre de RNase por reacción de transcripción inversa de 20 microlitros, y añadir 10 microlitros de cada muestra de mezcla de reacción a cada pozo de una respuesta inflamatoria de ratón precargada y una matriz de microRNA PCR autoinmunitaria. La etapa proestrus se puede identificar por la presencia de células epiteliales nucleadas de forma redonda y bien formadas. Cuando el ratón está en la etapa estrus, se observan racimos densamente llenos de células epiteliales anucleadas, cornificadas y escamosas en el frotis.
Durante los metestrus, se observan células epiteliales cornificadas y leucocitos polimorfonucleares. En los diestrus, los leucocitos son generalmente más frecuentes. Arn extraído de cuatro pulmones de ratón, como se ha demostrado, exhiben concentraciones de ácido nucleico que oscilan entre 1198 y 2178 nanogramos por microlitro y una relación media de A260 a A280 entre 2,01 y 2,02, y una relación media de A260 a A230 entre 2,139 y 2,233.
En esta tabla, se muestran cambios dobles en la expresión de microRNA entre el ozono y los ratones expuestos al aire filtrado. Después del filtro de destino de microRNA y el análisis del núcleo para 14 microRNAs, para obtener la relación de registro de expresiones significativa y los valores P, estos datos pueden ser mapeados por el filtro de destino de microRNA. El análisis básico también proporciona información sobre las vías canónicas, las enfermedades y la función, los reguladores y las redes.
Además, el software de análisis funcional se puede utilizar para producir un análisis de red que muestre la relación entre los microARN de interés y otras moléculas. Al intentar este procedimiento, es importante comprobar el ciclo de estrus diariamente durante al menos tres ciclos consecutivos antes de realizar un experimento. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para responder preguntas adicionales sobre la expresión génica inflamatoria pulmonar a través del ciclo de estrus.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para otros investigadores en el campo de la inmunidad pulmonar para explorar mecanismos de regulación de la hormona sexual utilizando otros modelos.
