Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención Busch Biomédica, NSF subvención IBN-0548543, NSF IBN-0919747 conceder, March of Dimes Foundation Grant 1-AF04-107, March of Dimes Foundation Grant 1-AF08-464 (a BLF). MKK y CGL fueron apoyados por NIH Biotecnología Capacitación subvención T32 GM008339-20, y CGL también fue apoyada por una Comisión de Nueva Jersey en la columna vertebral de becas predoctorales de investigación sobre médula 08-2941-SCR-E-0.

1. Antes de empezar: 1) E18 disección de la rata: Los métodos estándar de la disección de las neuronas del hipocampo E18 han sido descritos previamente 13. Con el fin de utilizar el programa hoguera para analizar las características morfológicas de las neuritas, de 8 bits. TIF de las neuronas individuales deben ser obtenidos. Esto se puede lograr de varias maneras, según el protocolo experimental que se está siguiendo. Las neuronas pueden ser chapada a una densidad suficientemente baja para que las neuronas individuales aparecen en el campo del microscopio. Por otra parte, a las neuronas individuales de la imagen que se cultivan en un cultivo denso, las neuronas pueden ser transfectadas utilizando una variedad de métodos de transfección con un plásmido que codifica una proteína fluorescente. 2) Requisitos de software y la instalación: <ol class="ualpha"><li> El plug-in para el software NeuronJ ImageJ de NIH y NeuronStudio deben estar instalados para poder ejecutar el programa de la hoguera. Los paquetes de software se puede encontrar en las siguientes páginas web: ImageJ - <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> NeuronJ - <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> NeuronStudio - <a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a> </li><li> El programa de la hoguera se puede encontrar en http://lifesci.rutgers.edu/ ~ Firestein. El manual del usuario hoguera también está disponible en este sitio web. Además, la descripción inicial de la hoguera se pueden encontrar en Langhammer et al, Citometría de 2010. Todos los datos han sido analizados mediante un sistema operativo Windows. </li></ol> 3) Ajuste de imagen Resolución: Usted tendrá que ajustar el programa de la hoguera sobre la base de la resolución de imagen de las imágenes que se desea analizar. En la parte bonfire_parameters del programa de Bonfire, sustituya el valor actual de la pix_conv variable con el valor de la resolución de la imagen (m / pixel) de las imágenes. 2. Estructura del archivo: Con el fin de la hoguera para analizar los datos, los archivos deben estar organizados de esta estructura específica (Figura 2). Usted tendrá que: <ul><li> Una carpeta principal </li><li> Sub-carpetas (que contienen cada uno de sus diferentes condiciones) </li><li> Archivos de celda de la imagen (archivos filename.tif) contenidos en las carpetas de diferentes condiciones </li><li> Una carpeta que contiene la hoguera hoguera Matlab mfiles (también se encuentra en la carpeta principal) </li></ul> 3. Las neuronas de búsqueda en NeuronJ: <ol><li> Preparar la imagen para el rastreo <ol class="lalpha"><li> Abra la imagen, seleccionando el botón &quot;Abrir&quot; en la barra de herramientas y NeuronJ seleccionar la imagen que le gustaría dejar rastro. </li><li> Cambiar el tamaño de la imagen mediante la selección de la &#39;maximizar&#39; botón. </li><li> Ajustar el brillo y el contraste de la imagen para que pueda visualizar todas las neuritas mediante la selección de &#39;Imagen&#39; en la barra de herramientas NeuronJ luego seleccionar &quot;Ajuste de brillo / contraste. </li></ol></li><li> Rastrear el cuerpo de la célula en NeuronJ e identificar la huella como &quot;Tipo 06&quot; <ol class="lalpha"><li> Seleccione el botón &quot;Añadir Rastros&quot; en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Trace una línea alrededor del perímetro del cuerpo celular. </li><li> Seleccione el botón &#39;Trazos de etiquetas &quot;en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Seleccione &#39;N1&#39; de la &#39;Tracing ID &quot;del menú desplegable. </li><li> &quot;Tipo 06&quot;, seleccione en el NeuronJ: Atributos de la ventana y seleccione &quot;Aceptar&quot;. </li></ol></li><li> Traza las neuritas en NeuronJ <ol class="lalpha"><li> Seleccione el botón &quot;Añadir Rastros&quot; en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Añadir un recorrido a lo largo de cada rama de las neuritas. Sólo puede seleccionar las dendritas o axones, en función de su experimento. </li><li> Le sugerimos que los segmentos de dibujar parar en cada punto de ramificación, con cada punto de ramificación hija a partir de ese momento como una nueva traza. </li><li> Seleccione el botón &quot;Guardar trazados&quot; en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Guardar el trazado que acaba de crear en la misma carpeta que el archivo de imagen original. </li></ol></li><li> Exportar los archivos de rastreo y el archivo de seguimiento identificador de NeuronJ Dos tipos de archivos deben ser exportados de NeuronJ y se guardan en las carpetas de las condiciones adecuadas, junto con el. Tif y archivos. NDF. <ol class="lalpha"><li> Seleccione el botón &quot;Seguimiento de exportación&quot; en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;-deliminated archivos de texto: archivo separado para&quot; opción en el &#39;cada trazado NeuronJ: Exportar&#39; cuadro de diálogo y seleccione &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Permitir NeuronJ para elegir los nombres de los archivos y la ubicación de almacenamiento. </li><li> Seleccione el botón &#39;Trazos medida&#39; en la barra de herramientas NeuronJ. </li><li> Selecciona la opción &quot;Mostrar las mediciones de seguimiento &#39;en el&#39; NeuronJ: Medidas &#39;ventana y seleccione&quot; Ejecutar &quot;. </li><li> &#39;Archivo&#39; seleccione el &#39;NeuronJ: Trazos &quot;de la ventana. </li><li> Seleccione &quot;Guardar como&quot; y guarde el archivo como Filename_info. &#39;Archivo&#39; debe coincidir exactamente con el nombre del archivo de imagen original (incluyendo la capitalización), seguido por _info y no debe contener una carta de 3 de extensiones de archivos. Por ejemplo, para Cell20.tif nombre original de la imagen, este archivo se llamaría &#39;Cell20_info. Verifique que su equipo no agrega automáticamente una extensión de archivo. Xls. Si lo hace, la extensión de archivo se deben eliminar manualmente. </li></ol></li></ol> 4. Use la hoguera para construir archivos SWC preliminares de los datos NeuronJ.: <ol><li> Reorganizar las carpetas con &quot;bonfire_load &#39; <ol class="lalpha"><li> Abra Matlab haciendo doble clic sobre el icono. </li><li> Haga clic en el botón &#39;en la parte superior derecha de la ventana de comandos. </li><li> Seleccione la &#39;hoguera&#39; carpeta en la carpeta principal en el &quot;Buscar carpeta&quot; ventana. </li><li> Tipo &#39;bonfire_load&#39; en la ventana de comandos del Matlab y pulse enter. </li><li> Seleccione la carpeta condición de que usted desea analizar en el &quot;Buscar carpeta&quot; ventana y seleccione &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Esto se reorganizará la estructura de carpetas mediante la creación de células sub-carpetas que contienen todos los datos de cada celda individual. </li></ol></li><li> Crear archivos filename_prelim.swc con &#39;bonfire_ndf2swc&#39; <ol class="lalpha"><li> &quot;Bonfire_ndf2swc&quot; escribir en la ventana de comandos y pulse Intro. </li><li> Seleccione la carpeta mismas condiciones que le acaba de reorganizar con &#39;bonfire_load &quot;en el&quot; Buscar carpeta &quot;ventana y seleccione&quot; Aceptar &quot;. </li><li> Esto creará un archivo. Swc en cada carpeta de células de la condición de elegido. Cada carpeta celular ahora tendrá 5 ficheros,. Tif la imagen original, el archivo de NDF, el archivo de identificador de traza _info, un archivo txt y un archivo SWC.... </li></ol></li></ol> 5. Use NeuronStudio para Finalizar archivos SWC.: <ol><li> Abrir y calibrar las imágenes de neuronas en NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Abra el programa NeuronStudio. </li><li> Seleccione Archivo → Abrir en la barra de herramientas NeuronStudio. </li><li> Encontrar la imagen. Tif de la neurona que desea modificar y abrirlo. </li><li> Seleccione Ejecutar → Configuración e introduzca &#39;1 &#39;en cada uno de los 3 (X, Y, Z) cajas en la &quot;ventana de tamaño de vóxel. </li><li> Seleccione Archivo → Importar SWC. Seleccione el archivo correspondiente. SWC. El archivo de imagen ahora se superpone con una imagen de rastreo. El soma celular debe ser cubierta con un círculo rojo. </li></ol></li><li> Use NeuronStudio de neuritas enlace <ol class="lalpha"><li> Utilice las herramientas en NeuronStudio para identificar correctamente los puntos de ramificación y el punto final (le recomendamos que se familiaricen con las características NeuronStudio y accesos directos antes de analizar los datos). </li><li> En concreto, el uso de la &quot;herramienta de neuritas para unirse a los nodos de modo que: <ul><li> Cada punto de ramificación (nodos amarillos) sólo se pueden crear dos ramas </li><li> Todos los rastros se continua con el soma (sólo un nodo rojo) </li></ul></li></ol></li><li> Exportar datos de NeuronStudio <ol class="lalpha"><li> Seleccione Archivo → Guardar neuritas (salvo que el nombre por defecto). </li></ol></li><li> Compruebe si hay errores en el. Swc archivos utilizando &quot;bonfire_trace_check &#39; <ol class="lalpha"><li> &quot;Bonfire_trace_check&quot; escribir en la ventana de comandos MathLab y pulse enter. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que acaba de procesar en el &quot;Buscar carpeta&quot; ventana y seleccione &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Si hay algún error en alguna de las imágenes de la carpeta el programa mostrará las imágenes que muestran que el error se encuentra. </li><li> Corrección de errores en NeuronStudio <ol class="lroman"><li> Abra el archivo de imagen que guardó en el paso de la exportación. </li><li> Localizar y solucionar el problema (s). </li><li> Haga clic en Archivo → Guardar neuritas. </li><li> Repita para otras imágenes que necesitan ser corregidos. </li><li> Vuelva a ejecutar &#39;bonfire_trace_check&#39; (5,4). </li></ol></li></ol></li></ol> 6. Use &#39;hoguera&#39; para extraer datos morfológicos de los archivos SWC.: <ol class="lalpha"><li> &#39;Hoguera&#39; escribe en la ventana de comandos y pulse Intro. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que desea analizar en el &quot;Buscar carpeta&quot; ventana y seleccione &quot;Aceptar&quot;. </li><li> El análisis de la hoguera se generará una ventana para cada una de las neuronas que se analiza, en la que los gráficos de la morfología neuronal junto con los anillos Sholl utilizados en el análisis. Además, el comando &#39;hoguera&#39; va a generar el archivo. Estera que contiene toda la información morfológica que se ha tomado del análisis. </li></ol> 7. Use &#39;bonfire_results&#39; para ver los datos: <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_results&#39; en la ventana de comandos del Matlab. </li><li> Seleccione la carpeta de condiciones para la condición que le gustaría ver en el &quot;Buscar carpeta&quot; ventana y seleccione &quot;Aceptar&quot;. </li><li> El &quot;Buscar carpeta&quot; ventana se cerrará temporalmente y volver a abrir, lo que le permite seleccionar las condiciones adicionales que le gustaría ver. </li><li> Cuando haya terminado de seleccionar las carpetas condición, seleccione &quot;Cancelar&quot; para salir del proceso de selección. </li><li> &quot;Bonfire_results &#39;volverá tablas resumen que incluya ªlos datos de las carpetas de correo condición de que haya seleccionado. </li></ol> 8. Use &#39;bonfire_export &quot;para exportar datos a Excel: <ol class="lalpha"><li> Tipo &#39;bonfire_export&#39; en la ventana de comandos. </li><li> Seleccione la carpeta que contiene el estado de los datos que desea exportar en el &quot;Buscar carpeta&quot; ventana y seleccione &quot;Aceptar&quot;. Bonfire_export creará archivos de Excel de los datos morfológicos y los colocará en la carpeta condición de que fue seleccionado. </li></ol> 9. Los resultados representativos: Un ejemplo de los datos generados por el programa de la hoguera en un conjunto de datos que contiene dos condiciones se muestra en la Figura 3. En este ejemplo, un Estado de las neuronas contienen más neuritas distal al cuerpo celular. Este fenómeno se puede observar en las imágenes de ejemplo (Figura 3 B), así como en la curva de Sholl de la dendríticas total de árbol (Figura 3) y en la gráfica de la cantidad de puntos terminales (Figura 3C). Además, debido a que el programa de la hoguera también realiza análisis de Sholl en las subregiones de las imágenes, que son capaces de identificar más específicamente la identidad de las neuritas que se han incrementado. Tanto el número total de intersecciones de orden 3 º o más neuritas (Figura 3F) y el número total de los intermediarios y neuritas terminal (Figura 3G) aumentan distal al cuerpo celular. Estas tendencias también se pueden observar en las figuras 3D y 3E. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1:. Diagrama de flujo del programa de Bonfire Las neuronas son trazados con ImageJ. Los datos se exportan y se convirtió en el programa hoguera en archivos SWC preliminar.. NeuronStudio se utiliza para definir la conectividad de las neuritas. Cheques hoguera de los errores y luego calcula las curvas de Sholl, el número de neuritas primaria, para secundaria y superior, y el número de puntos de ramificación y consejos de las neuritas. Finalmente, los datos son exportados a Excel para su análisis estadístico. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Estructura de los archivos necesarios para el análisis Hoguera La estructura del archivo debe coincidir con este o el programa no funcionará correctamente.. Los nombres de las carpetas y los archivos y la cantidad de las carpetas y los archivos se puede cambiar. <img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Ejemplo de datos de salida del programa de una fogata curvas) Total Sholl.. B) Ejemplo invertida imágenes de ambas condiciones. C) Número promedio de puntos de ramificación y en los extremos / celular. D) Número medio de procesos / celular de primaria, secundaria y terciaria o superior neuritas. E) Promedio de procesos / celular de la raíz, intermedio y neuritas terminal. F) Segmento de la identidad específica de las curvas de análisis Sholl. Los segmentos se agrupan en primaria, secundaria o terciaria o superior. G) Segmento de la identidad específica de las curvas de análisis Sholl. Los segmentos se agrupan en los segmentos de raíz, los segmentos intermedios, o segmentos de la terminal.

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Las agencias de financiación no tiene función científica en el desarrollo de la hoguera.

El programa de la hoguera es un programa semi-automático para el análisis de la dendrita y axón morfología. Se aumenta la eficiencia y la exactitud del análisis de Sholl sobre la realización del análisis de forma manual. Además, el programa guarda los datos de la hoguera en cada paso del proceso, por lo que es posible auditar los datos y verificar la exactitud de los análisis. Por lo tanto, la tarea de análisis de datos se pueden distribuir a numerosas personas sin comprometer la precisión. Por último, media...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
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<td>NeuronJ plugin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Bonfire program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://lifesci.rutgers.edu/~firestein">http://lifesci.rutgers.edu/~firestein</a></td>
</tr>
<tr>
<td>NeuronStudio</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MatLab Program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MathWorks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated sholl analysis of digitized neuronal morphology at multiple scales

Morfología neuronal desempeña un papel importante en la determinación de cómo las neuronas funcionar y comunicarse 1-3. En concreto, afecta a la capacidad de las neuronas para recibir aportes de otras células 2 y contribuye a la propagación de potenciales de acción 4,5. La morfología de las neuritas también afecta a la información es procesada. La diversidad de morfologías dendríticas facilitar la señalización de rango local y de larga y permitir que las neuronas individuales o grupos de neuronas para llevar a cabo funciones especializadas dentro de la red neuronal 6,7. Alteraciones en la morfología dendrítica, incluyendo la fragmentación de las dendritas y los cambios en los patrones de ramificación, se han observado en varios estados de la enfermedad, incluyendo la enfermedad de Alzheimer 8, 9,10 esquizofrenia y retraso mental 11. La capacidad tanto de entender los factores que determinan morfologías dendríticas e identificar los cambios en la morfología de las dendritas es esencial en la comprensión de la función del sistema nervioso y la disfunción. Morfología de las neuritas se analiza a menudo por el análisis de Sholl y contando el número de neuritas y el número de puntas de las ramas. Este análisis se aplica generalmente a las dendritas, pero también se puede aplicar a los axones. Realizar este análisis con la mano es a la vez mucho tiempo e inevitablemente introduce la variabilidad debida a la predisposición del experimentador y la incoherencia. El programa de la hoguera es un método semi-automatizado para el análisis de la dendrita y axón morfología que se basa en código abierto disponibles herramientas de análisis morfológico. Nuestro programa permite la detección de cambios locales en la dendrita y axón ramificaciones comportamientos mediante la realización de análisis de Sholl en las subregiones de la glorieta neuríticas. Por ejemplo, el análisis de Sholl se realiza en tanto la neurona en su conjunto, así como en cada subconjunto de procesos (primaria, secundaria, terminal, raíces, etc) y los patrones Dendrite axón está influenciada por una serie de factores intracelulares y extracelulares, muchos actuar localmente. Por lo tanto, la morfología cenador resultante es el resultado de procesos específicos que actúan sobre las neuritas específicos, por lo que es necesario realizar el análisis morfológico en una escala menor a fin de observar estas variaciones locales 12. El programa de Bonfire requiere el uso de dos herramientas de análisis de código abierto, el plug-in para ImageJ NeuronJ y NeuronStudio. Las neuronas son trazadas en ImageJ y NeuronStudio se utiliza para definir la conectividad entre las neuritas. Hoguera contiene una serie de scripts escritos en MATLAB (The Mathworks) que se utilizan para convertir los datos en el formato adecuado para su posterior análisis, comprobación de errores de usuario, y en última instancia, el análisis Sholl. Finalmente, los datos son exportados a Excel para su análisis estadístico. Un diagrama de flujo del programa de la hoguera se muestra en la Figura 1.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Hemos desarrollado un programa de computadora para analizar la morfología neuronal. En combinación con dos herramientas existentes de código abierto de análisis, nuestro programa realiza análisis de Sholl y determina el número de neuritas, los puntos de ramificación, y consejos de las neuritas. Los análisis se realizan para que los cambios locales en la morfología de las neuritas se puede observar.

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

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Research

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33.3K vistas.  Rutgers University. Hemos desarrollado un programa de computadora para analizar la morfología neuronal. En combinación con dos herramientas existentes de código abierto de análisis, nuestro programa realiza análisis de Sholl y determina el número de neuritas, los puntos de ramificación, y consejos de las neuritas. Los análisis se realizan para que los cambios locales en la morfología de las neuritas se puede observar.

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Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Investigación

Neurociencias

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent and divergent anatomical connections including feed forward and feedback wiring. Furthermore, information of the same origin is partially sent via parallel pathways to different and sometimes into the same brain areas. To understand the evolutionary benefits as well as the computational advantages of these wiring strategies and especially their temporal dependencies on each other, it is necessary to have simultaneous access to single neurons of different tracts or neuropiles in the same preparation at high temporal resolution. Here we concentrate on honeybees by demonstrating a unique extracellular long term access to record multi unit activity at two subsequent neuropiles1, the antennal lobe (AL), the first olfactory processing stage and the mushroom body (MB), a higher order integration center involved in learning and memory formation, or two parallel neuronal tracts2 connecting the AL with the MB.&#160;The latter was chosen as an example and will be described in full. In the supporting video the construction and permanent insertion of flexible multi&#160;channel wire electrodes is demonstrated. Pairwise differential amplification of the micro&#160;wire electrode channels drastically reduces the noise and verifies that the source of the signal is closely related to the position of the electrode tip. The mechanical flexibility of the used wire electrodes allows stable invasive long&#160;term recordings over many hours up to days, which is a clear advantage compared to conventional extra&#160;and intracellular in vivo recording techniques.

Simultaneous extracellular long term recordings from two different brain neuropiles or two different anatomical tracts were established in honeybees. These recordings allow the investigation of temporal aspects of neuronal processing across different brain areas at the single neuron as well as at the ensemble level in a behaving animal.

Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

La medición de la discapacidad neurológica progresiva en un modelo de ratón de la esclerosis múltiple

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análisis de la marcha automática en ratones con lesión de la constricción crónica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...