Gli autori desiderano ringraziare Lonza Walkersville per la loro assistenza con conoscenza del sistema chiuso, il design borsa, prestito di sigillanti borsa e saldatori, oltre a creare la borsa a schemi HyperStack.

1. HyperStack nave - gas permeabili Background Material Technology <ol><li> La nave è una nave HyperStack multistrato per la coltura di cellule del sistema chiuso che si basa sullo scambio di gas attraverso un film di gas 76.2micron permeabile polimero per il metabolismo cellulare. </li><li> La nave HyperStack differisce dai vasi delle cellule più tradizionali della cultura, nel senso che non ha una &quot;spazio di testa&quot; al di sopra delle celle all&#39;interno della nave. Piuttosto che contiene questo &quot;spazio di testa&quot; per lo scambio di gas all&#39;interno della nave, i prodotti del gas permeabili sono spazi aerei (di seguito &quot;tracheale&quot; spazi) sotto ogni camera di cultura che è aperto verso l&#39;atmosfera. </li><li> Questo spazio tracheale permette alle cellule in crescita in ogni comparto coltura cellulare della nave per avere scambi di gas equivalente. </li><li> Il film di gas permeabile permette lo scambio di gas si verifichi, pur mantenendo un ambiente sterile. Tutte le manipolazioni di liquidi per ciascuno degli strati più avvenire attraverso una porta singola voce. </li></ol> 2. HyperStack nave Component Summary <ol><li> Il Stackette è l&#39;individuo vano di coltura cellulare che si compone della piastra superiore e la pellicola di gas permeabili. Le cellule sono coltivate all&#39;interno di questo comparto. </li><li> Il collettore liquido collega ciascuno dei 12 strati stackette insieme all&#39;interno di un modulo HyperStack. I moduli sono collegati con tubi a formare vasi in multipli di 12 strati. Il collettore permette all&#39;utente di fare una manipolazione di liquidi per l&#39;intero vaso. </li><li> Il collettore Air collega anche gli strati stackette insieme, ma è usato per spostare l&#39;aria dalla nave quando si verificano le aggiunte di liquidi. Esso contiene una linea di riempimento per l&#39;utilizzo durante il riempimento. </li><li> Lo spazio tracheale è lo spazio all&#39;aperto tra ogni strato stackette, permettendo lo scambio di gas si verifichi attraverso il cinema gas permeabili ogni layer &#39;. </li><li> Il tubo di manipolazione dei liquidi è collegato al collettore liquido e viene usato per fare tutto chiuso manipolazioni fluido sistema. Questo componente può essere personalizzato. </li><li> Il tubo di sfiato è collegato al collettore dell&#39;aria, contiene un filtro dell&#39;aria, ed è utilizzato per rilasciare l&#39;aria in eccesso mantenendo la sterilità. </li><li> Il tubo caccia dispone di un filtro e morsetto e sono collegati al tubo di gestione dei liquidi e vengono utilizzati per evacuare il fluido dal tubo di gestione dei liquidi dopo il riempimento della nave. </li><li> Il manipolatore Stack Corning o CSM è un dispositivo di gestione per aiutare a collocare i vasi nelle posizioni corrette durante l&#39;uso. </li><li> Il cuneo di riempimento è un acciaio inossidabile assistere utilizzato quando compilare manualmente i vasi HyperStack. </li></ol> 3. Diffusione risultati di gas attraverso film permeabile ai gas usato nei vasi HyperStack <ol><li> Nei sistemi tradizionali la crescita cellulare con spazio di testa ventilati, l&#39;ossigeno nei media è impoverito una media del 50% nell&#39;arco di 3 giorni in coltura. (Figura 1) </li><li> Nello stesso sistema crescita cellulare, il gradiente di ossigeno in un altezza di 3 mm di media è quasi il 50% maggiore alla media per spazio di testa all&#39;incrocio di quanto lo sia a livello cellulare. (Figura 2) </li><li> La diffusione di ossigeno attraverso il film di polistirene 76.2micron gas permeabili è uguale alla diffusione attraverso i media di 2,6 millimetri. La pellicola permeabile ai gas utilizzati nei vasi HyperStack permette lo scambio di gas si verifichi a livello cellulare. </li><li> La% di ossigeno nello spazio tracheale dei vasi HyperStack rimane costante, come le cellule crescono a confluenza. (Figura 3) </li></ol> 4. Borsa media Preparazione <ol><li> I-12 HyperStack nave strato prende 1.3L dei media e il HyperStack-36 nave strato prende 3.9l dei media. </li><li> Prima di inoculare il supporto insaccato, se i livelli sierici deve essere utilizzato, tubo di saldare il sacchetto siero alla borsa media e mescolare accuratamente. </li><li> Morsetto fuori circa 300 ml di mezzi di comunicazione nella busta utilizzando fascette grossa borsa. Questo garantirà tutte le cellule inoculate vengono utilizzati durante il riempimento e nessuno è ancora nel sacchetto dei media. Luogo borsa multimediale su supporto borsa. </li></ol> 5. Media inoculando <ol><li> Riempire una siringa con un tubo attaccato con sospensione cellulare. Tubo di saldatura &quot;tubo 3 / 16 da una siringa contenente sospensione cellulare alla borsa media. </li><li> Iniettare la sospensione cellulare in Borsa Media e mescolare bene. </li></ol> 6. Compila procedura <ol><li> Tubo di saldare il sacchetto inoculati media della nave HyperStack di 3 / 8 &quot;tubing manipolazione dei liquidi. (Utilizzando sterili collega o collega Multipurpose (PPM), è possibile anche allegare la borsa media per nave). </li><li> Chiudere i morsetti sulla gestione dei liquidi e tubi inseguire sul HyperStack. </li><li> Posizionare i 36 Vessel strato HyperStack nel CSM in posizione di carico; agganciare il tubo di sfiato del filtro nel morsetto tenendosi il CSM. Serrare il coperchio e spostare il CSM in posizione di riempimento. Mettendo la nave nella posizione corretta riempimento, il filtro dell&#39;aria è ora in posizione più alta per evitare bagnare durante il funzionamento di riempimento. L&#39;angolo di 10 ° permette equilibrzione del liquido negli strati durante il riempimento. Il HyperStack-12 nave strato posizionato su un lato sul cuneo di riempimento è nella posizione corretta per il riempimento. </li><li> Aria limpida dalla linea di riempimento posizionando la borsa allo stesso livello della nave HyperStack (non superiore). Mantenere la fascetta del tubo caccia chiusa, aprire la fascetta del tubo liquido manipolazione e la pinza borsa mezzi di comunicazione per consentire fluido per entrare nella nave. </li><li> Utilizzando il supporto borsa, sollevare la borsa media per aiutare il flusso di sospensione cellulare nel vaso. </li><li> Riempire il serbatoio, fino tutti i supporti inoculati entra nella nave, il ml 300 di media dovrebbero ancora rimanere nella parte superiore della borsa media. Rimuovere la fascetta dal sacchetto supporto per continuare riempire il serbatoio. Come liquido si avvicina il collettore d&#39;aria superiore, rallentare il tasso di riempimento abbassando la borsa media al fine di prevenire più di riempimento. Portare lentamente il livello del liquido per la linea di riempimento e bloccare il tubo liquido di movimentazione. </li></ol> 7. Procedura per l&#39;isolamento di blocco a liquido negli strati <ol><li> Portare la nave HyperStack nel CSM in posizione di isolamento in modo entrambe le serie di collettori sono nella posizione più alta e più bassa la borsa dei media sotto l&#39;altezza del vaso. I-12 HyperStack nave livello può essere sollevato in posizione di isolamento mettendo una mano sul fianco della nave e con l&#39;altra per sollevare il cuneo di riempimento. </li><li> Con il filtro di caccia tenuto in posizione verticale, aprire il morsetto caccia tubo. Questo vuoto o inseguire i media nel tubo di gestione dei liquidi nuovamente dentro il sacchetto dei media. Una volta che il tubo è vuoto, chiudere il morsetto sul tubo borsa media. </li><li> Mantenere il filtro caccia tubo in posizione verticale, aprire il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi sul HyperStack per consentire eventuali residui di liquido di entrare ed equilibrare nel vaso. Attendere 1-2 minuti per questo si verifichi. </li><li> Girare la nave HyperStack nel CSM in modo che i collettori sono a sinistra. Abbassare la nave alla posizione del carico sul CSM. Dondolo la HYPEStack-12 nave strato leggermente a sinistra consentirà la rimozione del cuneo di riempimento. Chiudere i morsetti sia sulla caccia e il tubo di gestione dei liquidi. </li><li> La borsa media possono ora essere smontato o può rimanere attaccato per un uso successivo nella procedura di raccolta. Per memorizzare il sacchetto attaccato i media, tira il sacchetto vuoto e tutta la carta rimasta nel sacco, e posto sotto le bande conservando nel cassetto di stoccaggio della nave HyperStack. </li><li> Spostare la nave HyperStack alla incubatrice. Nell&#39;effettuare la cura nave da adottare per mantenere liquido di entrare nel filtro di sfiato. Questo si ottiene inclinando la fine del molteplice HyperStack leggermente verso l&#39;alto. </li></ol> 8. Harvest protocollo <ol><li> Per iniziare la procedura di raccolta, tubo saldare la soluzione delle cellule dissociazione e borse spegnere insieme per formare l&#39;assemblea sacchetto di raccolta. Assicurarsi che tutte le fascette tubi sono chiusi. (Usa cartoon dimostrare) </li><li> Rimuovere nave HyperStack dal termostato, rilasciare il sacchetto dei media da sotto le bande di sostegno, e appendere allo stand borsa. Mettere il recipiente nel CSM in posizione di carico e serrare il coperchio per fissare il vaso. Agganciare il tubo di sfiato nel morsetto holding e spostare il CSM in posizione di riempimento. </li><li> Assicurarsi che il sacchetto dei media presso lo stand sacchetto è appeso inferiore al HyperStack, aprire il morsetto sul tubo borsa media e tubi di gestione dei liquidi della nave di consentire ai media di fluire nel sacchetto attaccato. </li><li> Una volta che la nave è di circa ¾ vuoto, modificare le impostazioni del CSM per la posizione finale vuota. Quando la nave HyperStack e il tubo di gestione dei liquidi sono vuote, sollevare il tubo di inseguire i media oltre il morsetto sul tubo speso borsa media, quindi chiudere sia il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi e la fascetta sul tubo speso borsa media. </li><li> Sostituire il sacchetto passato mezzi di comunicazione con l&#39;assemblea sacchetto di raccolta mediante saldatura di tubi e aumentare l&#39;altezza della riunione di cella borsa dissociazione sopra l&#39;altezza del HyperStack utilizzando il supporto borsa. </li><li> Posizionare il CSM in posizione di equilibrio. Aprire la cella tubo soluzione dissociazione morsetto e trasferire la soluzione nella HyperStack. Quando il trasferimento è stato completato, chiudere le fascette sul tubo di gestione dei liquidi e la cellula tubi soluzione dissociazione. </li><li> Portare CSM in posizione di carico. Tenendo premuto il posizionamento orizzontale leva di apertura, agitare delicatamente la parte nave a fianco con la ruota, distribuendo la soluzione negli strati di cellule. La nave può occasionalmente essere restituiti alla posizione di equilibrio durante dondolo per mantenere un&#39;equa distribuzione della soluzione. Esso non può essere visivamente evidente che gli strati sono completamente rivestiti, ma la soluzione dissociazione sarà equamente distribuita su tutta la superficie delle cellule. Una volta che la soluzione è stata adeguatamente distribuito, rilasciare la leva del CSM per bloccare il HyperStack in posizione di carico. Lasciare la HyperStack in questa posizioneper il tempo necessario per la dissociazione delle cellule. </li><li> Una volta che le cellule hanno staccato; torbidità utilizzando come guida, spostare il CSM in posizione di equilibrio. Si deve prestare attenzione a non digerire sulle celle. Aprire il morsetto spegnere borsa e il morsetto liquido HyperStack movimentazione tubi per consentire ai media spegnere per entrare nella nave. Chiudere il morsetto sul tubo di gestione dei liquidi HyperStack una volta completato il trasferimento. </li><li> Riportare il CSM in posizione di carico e tenere premuto la leva di posizionamento orizzontale al rock lato nave a lato. </li><li> Utilizzando il supporto borsa, abbassare la posizione del gruppo raccolta borsa sotto il livello del HyperStack. Regolare il CSM in posizione di vuoto, aprire il tubo liquido nave gestione morsetto e trasferire la soluzione cellulare nella borsa spegnere. Riportare il CSM in posizione di carico e scollegare l&#39;assemblea sacchetto raccolta dalla nave usando un sigillante tubo. La soluzione cellula è pronta per l&#39;elaborazione. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati <ul><li> Raccogliendo tempo ha bisogno di essere ottimizzato per la conversione da una superficie di polistirene standard per la superficie permeabile polistirolo gas. Le cellule tendono a rilasciare velocemente sul prodotto HyperStack. </li><li> Per visualizzare le cellule al microscopio la gestione di sfiato e tubi liquido deve essere bloccato al largo. Mettere il recipiente HyperStack a testa in giù, con i collettori verso il basso, sul palco microscopio. </li><li> Passi di prevenzione possono essere adottate per evitare di bagnare i filtri durante l&#39;uso che li farà smettere di funzionare. Da non più di riempire il serbatoio HyperStack e mantenendo il tubo di sfiato e di inseguire elevati quando i morsetti sono aperti, nessun bagnante dovrebbe verificarsi. </li><li> La pressione dei morsetti chiuso il tubo induce a rimanere chiuso dopo che i morsetti sono aperti. Pizzicare il tubo nella direzione opposta lo aprirà. </li><li> Tempo di flusso dei media entrando ed uscendo dal vaso HyperStack via a gravità si basa sulla differenza di altezza media tra il livello superiore della media della nave HyperStack e il livello superiore dei media nel contenitore multimediale. La distanza maggiore, più velocemente il flusso. La portata massima è limitata dalla valutazione dei filtri per 1.5L/min. </li><li> Mantenere adeguato volume di riempimento del serbatoio HyperStack impedirà la formazione di bolle d&#39;aria nelle camere di crescita della cellula. Le bolle d&#39;aria può verificarsi a causa di campionamento o incubando in un ambiente unhumidified a causa di perdita di acqua per evaporazione. La quantità e la frequenza di campionamento, nonché condizioni di incubazione determinerà se liquido, aggiungere da parte dell&#39;utente finale. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esaurimento di ossigeno dei media in un vaso standard di coltura cellulare. La figura mostra la diminuzione in mg / L di ossigeno a livello delle cellule in 3 giorni. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gradiente di ossigeno in media in un vaso standard di coltura cellulare. La figura mostra la mg / L di ossigeno è maggiore ai media di intersezione spazio di testa che a livello cellulare. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Percentuale di ossigeno nello spazio tracheale del HyperStack durante la crescita delle cellule. La figura mostra che oltre il 96 ore, la percentuale di ossigeno tra gli strati, che fornisce ogni permeabile fondo pellicola di gas, rimane costante. Questo dimostra la capacità delle cellule di accesso di ossigeno durante la crescita di confluenza.

La nave HyperStack tecnologia gas permeabile è coperta da brevetto US #: 7745209. Gli autori sono dipendenti di Corning Life Sciences, Inc., che produce lo strumento utilizzato in questo articolo.

Nave HyperStack ha coltivato con successo progettato, cellule primarie e staminali. Integrazioni del liquido all&#39;interno del serbatoio, sono stati condotti tramite connessioni sacco asettico da alimentazione per gravità e anche mediante pompaggio da un contenitore sterile media. La nave offre una maggiore di 2,5 volte aumento della superficie di crescita rispetto a un prodotto piatto impilati su lo stesso ingombro volumetrico. Il HyperStack-12 ha 6.000 cm 2 area di crescita, il HyperStack-36 ha 18 mila centimetri 2 Superficie crescita, e la HyperStack-120 ha 60.000 cm 2 di area di crescita. Aumentando la superficie, gli utenti sono in grado di produrre più cellule dalla popolazione stessa cella o lotto e ridurre la variabilità. Essi sono anche in grado di risparmiare spazio e / o lavoro utilizzando un numero di navi per raggiungere la stessa uscita cellulare, o aumentare la produzione di cellule senza l&#39;aggiunta di persone, suite camera bianca, o incubatori. Il sistema è prodotto con metodi a basso assemblaggio di particolato e senza l&#39;uso di collanti. Si tratta di un sistema chiuso che è confezionato con set di tubi e filtri, triple insaccate e fornito sterile.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

Grandi colture di cellule aderenti del volume è attualmente standardizzate sui prodotti cartilagine di accrescimento delle cellule impilate quando perline microcarrier non sono una scelta ottimale. Vasi HyperStack permettono scala sistema chiuso a partire dai prodotti attuali piastra impilati e fornisce&gt; 2,5 volte più cellule nel ingombro volumetrico stesso. I vasi HyperStack funzione di tramite materiale permeabile ai gas, che consente lo scambio di gas si verifichi, eliminando quindi la necessità di spazio di testa interna all&#39;interno di una nave. L&#39;eliminazione di spazio di testa permette il vano in cui la crescita delle cellule avviene per essere minimizzato per ridurre lo spazio, permettendo più strati di superficie crescita cellulare all&#39;interno della stesso ingombro volumetrico. Per molte applicazioni, come la terapia cellulare o di produzione di vaccini, un sistema chiuso è necessario per la crescita cellulare e la raccolta. La nave HyperStack consente inoltre di cellule e reagenti e la rimozione mediante sonda dai sacchetti media o altri metodi. Questo protocollo spiegherà la tecnologia alla base del materiale permeabile ai gas utilizzati nei vasi HyperStack, i risultati diffusione del gas per soddisfare le esigenze metaboliche di cellule, sistema chiuso protocolli di crescita cellulare, e diversi metodi di raccolta.

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Una introduzione nel protocollo tecnologia, e la gestione dei Vasi HyperStack Corning e accessori utilizzati per l&#39;alta cultura resa cellule aderenti. Il protocollo mostrerà come utilizzare i vasi sistema chiuso per la raccolta delle cellule aumentando rispetto agli attuali prodotti di Piastra impilati.

Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

closed-system-cell-culture-protocol-using-hyperstack-vessels-with-gas

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  Corning Life Science. Una introduzione nel protocollo tecnologia, e la gestione dei Vasi HyperStack Corning e accessori utilizzati per l'alta cultura resa cellule aderenti. Il protocollo mostrerà come utilizzare i vasi sistema chiuso per la raccolta delle cellule aumentando rispetto agli attuali prodotti di Piastra impilati.

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Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principi di Site-Specific ricombinasi (SSR) Tecnologia

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Ricerca

Biologia

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Ingegneria Cell-permeabile proteine

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Determinazione del numero delle cellule durante coltura cellulare utilizzando il contatore di cellule Scettro

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Una procedura di screening chimico per glucocorticoidi segnalazione con un reporter del sistema Zebrafish Larva Luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultura sistema per studiare lo sviluppo della tiroide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...