Les auteurs tiennent à remercier Lonza Walkersville pour leur aide à la connaissance du système fermé, conception du sac, prêt de scellants sac et soudeurs, ainsi que la création du sac pour schémas HyperStack.

1. Navire HyperStack - Gaz de fond la technologie des matériaux perméables <ol><li> Le navire est un navire HyperStack multicouche pour la culture système fermé de cellules qui s&#39;appuie sur les échanges gazeux à travers un film 76.2micron perméables aux gaz de polymères pour le métabolisme cellulaire. </li><li> Le navire HyperStack diffère de plus traditionnel des récipients de culture cellulaire en ce qu&#39;elle n&#39;a pas un &quot;espace libre&quot; au-dessus des cellules à l&#39;intérieur du navire. Plutôt que de contenant cette &quot;headspace&quot; pour l&#39;échange de gaz dans la cuve, les produits perméables aux gaz ont des espaces d&#39;air (appelée «la trachée&quot; espaces) sous chaque chambre de culture qui est ouvert à l&#39;atmosphère. </li><li> Cet espace permet aux cellules trachéales croissante dans chaque compartiment de culture cellulaire du navire d&#39;avoir un échange de gaz équivalent. </li><li> Le film de gaz perméable permet les échanges gazeux de se produire tout en préservant un environnement stérile. Toutes les manipulations des fluides pour chacune des couches multiples se produisent à travers un port d&#39;entrée unique. </li></ol> 2. Résumé HyperStack Component navire <ol><li> Le Stackette est le compartiment des cellules individuelles de la culture qui est constitué de la plaque supérieure et le film perméable au gaz. Les cellules sont cultivées dans ce compartiment. </li><li> Le collecteur de liquide relie chacune des 12 couches stackette ensemble au sein d&#39;un module HyperStack. Les modules sont connectés avec des tubes pour former des vaisseaux dans les couches multiples de 12. Le collecteur permet à l&#39;utilisateur de faire une manipulation fluide à l&#39;ensemble du navire. </li><li> Le collecteur d&#39;air relie également les couches stackette ensemble, mais elle sert à déplacer l&#39;air à partir du navire lorsque des ajouts d&#39;huile se produisent. Il contient une ligne de remplissage à utiliser pendant le remplissage. </li><li> L&#39;espace trachéale est l&#39;espace en plein air entre chaque couche stackette, permettant les échanges gazeux de se produire à travers le cinéma perméables aux gaz de chaque couches. </li><li> Le tube de manipulation liquide est reliée au collecteur de liquide et est utilisé pour faire toutes les manipulations fermée fluide du système. Ce composant peut être personnalisée. </li><li> Le tube d&#39;évent est relié au collecteur d&#39;air, contient un filtre à air, et est utilisée pour libérer l&#39;excès d&#39;air tout en préservant la stérilité. </li><li> Le tube Chase a un filtre et la pince et sont reliés à la tubulure de manipulation de liquides et sont utilisées pour évacuer le liquide de la tubulure de manipulation de liquides après remplissage de la cuve. </li><li> Le Manipulateur Stack Corning ou CSM est un dispositif de manutention pour faciliter le chargement des navires dans les positions correctes pendant l&#39;utilisation. </li><li> Le coin de remplissage est en acier inoxydable d&#39;aider utilisé lorsque remplissage manuel des vaisseaux HyperStack. </li></ol> 3. Résultats Diffusion du gaz à travers du film de gaz perméable utilisée dans les récipients HyperStack <ol><li> Dans les systèmes traditionnels de la croissance cellulaire avec headspace ventilé, de l&#39;oxygène dans les médias est appauvri une moyenne de 50% sur 3 jours de culture. (Figure 1) </li><li> Dans le système de la croissance des cellules mêmes, le gradient d&#39;oxygène dans une hauteur de 3mm de médias est presque 50% supérieur à la presse à la jonction headspace que c&#39;est à la couche de cellules. (Figure 2) </li><li> La diffusion de l&#39;oxygène à travers le film de gaz 76.2micron polystyrène perméable est égale à la diffusion à travers des médias 2.6mm. Le film perméables aux gaz utilisés dans les vaisseaux HyperStack permet l&#39;échange de gaz se produire à la couche de cellules. </li><li> Le% d&#39;oxygène dans l&#39;espace trachéal des vaisseaux HyperStack reste constant que les cellules se développent au point de confluence. (Figure 3) </li></ol> 4. Préparation sac médias <ol><li> Le navire HyperStack-couche 12 prend 1.3L de médias et de l&#39;HyperStack-36 navires couche prend 3.9L de médias. </li><li> Avant d&#39;inoculer vos médias ensachées, si le sérum doit être utilisé, tube à souder le sac de sérum dans le sac des médias et bien mélanger. </li><li> Pince off environ 300 mL de médias dans le sac de l&#39;aide de colliers grand sac. Cela permettra d&#39;assurer toutes les cellules inoculées sont utilisés pendant le remplissage et aucun n&#39;est restant dans le sac des médias. Placez les médias sac sur le stand de sac. </li></ol> 5. Médias inoculation <ol><li> Remplir une seringue avec des tubes attachés avec une suspension cellulaire. Tube à souder 3 / 16 &quot;tube d&#39;une seringue contenant la suspension cellulaire dans le sac des médias. </li><li> Injecter la suspension cellulaire dans le sac avec les médias et bien mélanger. </li></ol> 6. Remplissez la procédure <ol><li> Tube à souder le sac inoculé des médias à 3 / 8 &quot;tube de manipulation de liquides. Navire HyperStack (en utilisant stérile se connecte ou se connecte polyvalent (PPM), vous pouvez aussi attacher le sac des médias à la cuve). </li><li> Fermer les pinces sur la manipulation des liquides et des tubes sur la chasse HyperStack. </li><li> Placer le récipient HyperStack couche 36 dans le CSM dans la position de la charge; accrocher le tube d&#39;évent filtre dans la pince de fixation sur le CSM. Serrez le couvercle et placez le CSM à la position de remplissage. En mettant le bateau dans la bonne position de remplir, le filtre à air est maintenant dans la position la plus élevée pour empêcher mouillage pendant le fonctionnement de remplissage. L&#39;angle de 10 ° permet equilibrtion du liquide dans les couches lors du remplissage. Le navire couche HyperStack-12 placé sur le côté sur le coin de remplissage est dans la position correcte pour le remplissage. </li><li> Air pur de la ligne de remplissage par le positionnement du sac au même niveau que le navire HyperStack (non plus). Garder la bride du tube chasse fermée; ouvrir la pince de manipulation de liquides du tube et la pince sac de médias pour permettre au fluide d&#39;entrer dans le navire. </li><li> Utilisation du support sac, soulever le sac des médias pour aider à l&#39;écoulement de suspension de cellules dans le vaisseau. </li><li> Remplissez la cuve jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemble des milieux inoculés entre dans le bateau, le 300 ml de support doit toujours rester dans la partie supérieure du sac médias. Retirer le collier du sac des médias de continuer à remplir la cuve. Comme liquide s&#39;approche du collecteur d&#39;air supérieur, de ralentir le taux de remplissage en abaissant le sac des médias afin d&#39;éviter de trop remplir. Porter lentement le niveau du liquide à la ligne de remplissage et de serrer le tube de manipulation de liquides. </li></ol> 7. Procédure d&#39;isolement de l&#39;écluse de liquide dans les couches <ol><li> Amener le navire HyperStack dans le CSM à la position de l&#39;isolement afin que les deux ensembles de collecteurs sont dans la position la plus élevée et inférieure du sac des médias en dessous de la hauteur du récipient. Le navire HyperStack-12 couche peut être soulevé dans la position d&#39;isolement en plaçant une main sur le côté du navire et en utilisant l&#39;autre pour soulever le coin de remplissage. </li><li> Avec le filtre course tenue à une position verticale, ouvrez la bride du tube chasse. Ce sera vide ou chasser les médias dans le tube de manipulation de liquides dans le sac des médias. Une fois que le tube est vide, fermer la pince sur le tube sac de médias. </li><li> Garder le filtre du tube chasse dans une position verticale, ouvrir la pince sur le tube de manipulation liquides sur l&#39;HyperStack pour permettre à tout le liquide restant d&#39;entrer et de s&#39;équilibrer dans la cuve. Attendre 1-2 minutes pour que cela se produise. </li><li> Faire tourner le bateau HyperStack dans le CSM afin que les collecteurs sont sur la gauche. Abaissez le navire à la position de la charge sur le CSM. Rocking l&#39;HYPEStack-12 navires couche légèrement vers la gauche, permettre l&#39;enlèvement de la cale de remplissage. Fermer les pinces sur les deux tubes de la chasse et la manipulation de liquides. </li><li> Le sac des médias peuvent maintenant être retiré de la cuve ou il peut rester attaché pour une utilisation ultérieure dans la procédure de récolte. Pour stocker le sac attaché médias, rouler le sac vide et tout support restant dans le sac, et les placer sous les bandes de retenue dans le plateau de stockage du navire HyperStack. </li><li> Déplacer le navire HyperStack à l&#39;incubateur. Lors de la prise en charge des navires doivent être prises pour empêcher le liquide de pénétrer dans le filtre d&#39;aération. Ceci est accompli par la fin de basculement multiple de la HyperStack légèrement vers le haut. </li></ol> 8. Protocole de récolte <ol><li> Pour commencer la procédure de récolte, tube à souder la solution la dissociation cellulaire et sacs étancher ensemble pour former l&#39;ensemble de sac de récolte. S&#39;assurer que tous les colliers de tuyau sont fermées. (Utilisez bande dessinée pour montrer) </li><li> Retirer des navires HyperStack de l&#39;incubateur, la libération du sac des médias sous les bandes de soutènement, et accrocher sur le stand sac. Placer le récipient dans le CSM dans la position de la charge et serrer le couvercle pour sécuriser le bateau. Accrocher le tuyau d&#39;aération dans la pince de fixation et déplacer le CSM à la position de remplissage. </li><li> S&#39;assurer que le sac des médias sur le stand sac est suspendu inférieur au HyperStack; ouvrir la pince sur le tube sac de médias et de tubes du navire de manipulation de liquides pour permettre aux médias de couler dans le sac attaché. </li><li> Une fois que le navire est d&#39;environ ¾ vide, modifier les paramètres du CSM à la position finale vides. Lorsque le navire HyperStack et tubes de manipulation de liquides sont vides, soulevez le tube pour chasser les médias après la pince sur le tube sac de médias passé, puis fermez la fois la pince sur le tube de manipulation de liquides et de la pince sur le tube sac de médias passé. </li><li> Remplacer le sac passé médias avec l&#39;ensemble de sac de récolte par soudage de tubes et augmenter la hauteur de l&#39;assemblée sac de dissociation cellulaire dessus de la hauteur de l&#39;HyperStack l&#39;aide du support sac. </li><li> Placez le CSM dans la position d&#39;équilibration. Ouvrir le tube solution de dissociation cellulaire pince et le transfert de la solution dans la HyperStack. Lorsque le transfert est terminé, fermer les pinces sur le tube de manipulation de liquides et de la tuyauterie solution de dissociation cellulaire. </li><li> Apportez CSM à la position de chargement. En tenant le levier de positionnement horizontale ouverte, secouez légèrement le côté bateau à côté en utilisant la roue, la distribution de la solution sur les couches de cellules. Le navire peut parfois être retourné à la position d&#39;équilibration au cours bascule à maintenir une répartition égale de la solution. Il peut ne pas être visuellement évident que les couches sont complètement couché, mais la solution de dissociation sera également répartie sur toute la surface des cellules. Une fois la solution a été convenablement réparties, relâchez le levier sur le CSM pour verrouiller le HyperStack en position de chargement. Laissez le HyperStack dans cette positionpendant le temps nécessaire dissociation pour vos cellules. </li><li> Une fois que les cellules se sont détachées; utilisant la turbidité comme un guide, déplacez le CSM à la position de l&#39;équilibration. Il faut prendre soin de ne pas trop assimiler les cellules. Ouvrir la pince sac de trempe et le liquide de manipulation HyperStack pince tube pour permettre aux médias d&#39;entrer étancher le navire. Fermez la pince sur le tube HyperStack la manipulation de liquides lorsque le transfert est terminé. </li><li> Retour au CSM de la position de charge et maintenir le levier de positionnement horizontal au rock le côté bateau à côté. </li><li> Utilisation du support sac, abaisser la position de l&#39;assemblée sac de récolte en dessous du niveau de l&#39;HyperStack. Réglez le CSM à la position vide, ouvrez le tube de manutention des navires de liquide pince et transférer la solution de cellules dans le sac étancher. Retour au CSM de la position de chargement et de déconnecter l&#39;ensemble de sac de récolte de la cuve en utilisant un scellant le tube. La solution la cellule est prête pour la transformation. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs <ul><li> La récolte de temps doit être optimisé lors de la conversion d&#39;une surface de polystyrène standard à la surface de polystyrène perméable au gaz. Les cellules ont tendance à libérer plus rapidement sur le produit HyperStack. </li><li> Pour visualiser les cellules sous un microscope le tube d&#39;aération et de manipulation de liquide doit être serré au large. Placer le récipient HyperStack tête en bas, avec les collecteurs pointant vers le bas, sur la platine du microscope. </li><li> Mesures de prévention peuvent être prises pour éviter de mouiller les filtres lors de l&#39;utilisation qui sera amener à cesser de fonctionner. En ne plus remplir la cuve HyperStack et en gardant l&#39;évent et le tube chasse élevés lorsque les pinces sont ouvertes, aucune humidification devrait se produire. </li><li> La pression des pinces fermées sur le tube provoque de rester fermée après les pinces sont ouvertes. Pincer le tuyau dans la direction opposée de l&#39;ouvrir. </li><li> Temps d&#39;écoulement des médias entrant et sortant du navire HyperStack via l&#39;alimentation par gravité est basé sur la différence de hauteur entre le support de haut niveau des médias dans la cuve HyperStack et le niveau supérieur des médias dans le récipient médias. La plus grande distance, plus le débit. Le débit maximal est limité par la notation des filtres pour 1.5L/min. </li><li> Maintenir bon volume de remplissage de la cuve HyperStack permettra d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air dans les chambres à la croissance cellulaire. Les bulles d&#39;air peuvent se produire en raison de l&#39;échantillonnage ou en incubation dans un environnement unhumidified due à la perte d&#39;eau par évaporation. Le montant et la fréquence d&#39;échantillonnage ainsi que les conditions d&#39;incubation va déterminer si le liquide supplémentaires devraient être ajoutés par l&#39;utilisateur final. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Appauvrissement en oxygène des médias dans un récipient de culture cellulaire standard. La figure montre la diminution en mg / L d&#39;oxygène au niveau des cellules sur 3 jours. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Gradient d&#39;oxygène dans les médias dans un récipient de culture cellulaire standard. La figure montre l&#39;mg / L d&#39;oxygène est plus grande au média à l&#39;intersection headspace qu&#39;à la couche de cellules. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Pourcentage d&#39;oxygène dans l&#39;espace trachéale de l&#39;HyperStack pendant la croissance cellulaire. La figure montre que plus de 96 heures, le pourcentage d&#39;oxygène entre les couches, qui fournit chaque fond films perméables aux gaz, reste constante. Ceci démontre la capacité des cellules à l&#39;accès d&#39;oxygène pendant la croissance jusqu&#39;à la confluence.

Le navire HyperStack perméables aux gaz de technologie est couvert sous le brevet américain #: 7745209. Les auteurs sont des employés de Corning Life Sciences, Inc qui produit l&#39;instrument utilisé dans cet article.

Navire HyperStack a cultivé avec succès d&#39;ingénierie, des cellules primaires et des souches. Ajouts de liquide dans la cuve ont été menées via des connexions sac aseptique par alimentation par gravité et par pompage à partir d&#39;un contenant stérile médias. Le navire prévoit une augmentation supérieure à la croissance dans la zone de 2.5X contre un produit de plaques empilées le même encombrement volumétrique. Le HyperStack-12 a 6000 secteur de croissance cm 2, la HyperStack-36 a 18000 secteur de croissance cm 2, et le HyperStack-120 a 60 000 cm 2 de surface de croissance. En augmentant la surface, les utilisateurs sont capables de produire plus de cellules provenant de la même population cellulaire ou un lot et de réduire la variabilité. Ils sont également capables d&#39;économiser de l&#39;espace et / ou de travail en utilisant moins de bateaux pour atteindre la sortie même cellule, ou d&#39;augmenter la production de cellules sans ajout de personnes, des suites de salle blanche, ou les incubateurs. Le système est produit avec des méthodes d&#39;assemblage des particules faibles et sans l&#39;utilisation d&#39;adhésifs. C&#39;est un système fermé qui est prémonté avec des ensembles de tubes et les filtres, triple ensachés et fournis stériles.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

Grand volume de culture de cellules adhérentes est actuellement standardisées sur les produits plaques empilées croissance cellulaire lorsqu&#39;ils ne sont pas des perles microporteur un choix optimal. Vaisseaux HyperStack permettent échelle du système fermé à partir des produits actuels plaques empilées et offre&gt; 2.5X plus de cellules dans le bilan volumétrique même. Les navires HyperStack fonction via matériau perméable au gaz qui permet l&#39;échange de gaz de se produire, éliminant ainsi le besoin d&#39;espace libre interne au sein d&#39;un navire. L&#39;élimination de l&#39;espace libre permet le compartiment où la croissance des cellules se produit à minimiser afin de réduire l&#39;espace, permettant ainsi de plusieurs couches de surface de croissance des cellules dans l&#39;empreinte volumétrique même. Pour de nombreuses applications telles que la thérapie cellulaire ou la production de vaccins, un système fermé est nécessaire pour la croissance cellulaire et la récolte. Le navire HyperStack permet l&#39;ajout de cellules et de réactifs et la suppression via un tube à partir de sacs médias ou d&#39;autres méthodes. Ce protocole sera d&#39;expliquer la technologie derrière le matériel perméables aux gaz utilisés dans les vaisseaux HyperStack, les résultats de diffusion des gaz pour satisfaire les besoins métaboliques des cellules, fermées protocoles du système de la croissance cellulaire, et les méthodes de récolte différentes.

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Une introduction à la technologie, le protocole et la manutention des navires HyperStack Corning et accessoires utilisés pour le rendement élevé de culture de cellules adhérentes. Le protocole va montrer comment utiliser le système fermé des navires pour la récolte de cellules augmente plus les produits actuels plaques empilées.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.7K vues.  Corning Life Science. Une introduction à la technologie, le protocole et la manutention des navires HyperStack Corning et accessoires utilisés pour le rendement élevé de culture de cellules adhérentes. Le protocole va montrer comment utiliser le système fermé des navires pour la récolte de cellules augmente plus les produits actuels plaques empilées.

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Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principes de la recombinase site-spécifique (SSR) Technologie

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Recherche

Biologie

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Ingénierie cellulaire perméable protéines

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Déterminer le nombre de cellules pendant la culture cellulaire en utilisant le compteur cellulaire Sceptre

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Une procédure de dépistage chimique pour les glucocorticoïdes de signalisation avec un système de Reporter poisson zèbre Larve luciférase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...