PAC está parcialmente financiado por una subvención del NIH T32 a la Universidad de Wisconsin Programa de Formación Stem Cell (PA Clark). JSK fue parcialmente financiado por la Cátedra de Investigación Brain Tumor HEADRUSH, Roger Loff Memorial Fund GBM Investigación y la Fundación UW / Neurocirugía Brain Tumor Investigación y el Fondo de Educación. JCW y YH están parcialmente apoyado por el NIH subvención NIBIB 1R01EB009103-01.

1. BTSC de disociación celular BTSCs se derivan de pre-existentes cultivos crecidos en medio libre de suero de células madre como neuroesferas. cultura de la que se ha descrito previamente 10, 11. <ol><li> Preparar suspensión de células de BTSC derivados de neuroesferas. BTSC derivados de neuroesferas se recogen en un tubo cónico de 15 ml y se centrifugó a 900 rpm durante 5 minutos. Más rápido centrifugación puede cortar y / o daños en las neuroesferas. El sobrenadante se aspiró y cultura neuroesfera se resuspendieron en 0,5 ml de pre-calentado Accutase. Esta solución se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C permitiendo que las neuroesferas para aflojar. Las células se rompieron con mecánicamente 10-20 golpes suaves de una pipeta P100 y luego 1,5 ml de medio de células madre se añadió a las células para neutralizar el Accutase. </li><li> Los BTSCs se centrifugan a 1300 rpm durante 5 minutos, y se resuspendieron en 1 ml de medio de células madre. </li><li> Una parte alícuota de 50 l se retira de las suspension y se colocó en un tubo de microcentrífuga para el recuento celular. 50 l de azul de tripano se añade al tubo de Eppendorf y la suspensión se coloca en un hemocitómetro para el recuento celular. </li><li> Si es necesario después de recuento de células, medio adicional de células madre se añade a la suspensión BTSC para dar una densidad celular de 20.000 células vivas / medios mu l. </li></ol> 2. Fabricación de bi-capas SU-8 maestro y moldeo de sello PDMS (ver figura 1) Nuestro método de litografía óptica y litografía blanda para fabricar SU-8 maestro y sello PDMS, que son esenciales para el montaje de los dispositivos de microfluidos. Ligeramente diferente que el procedimiento estándar 12, nuestro SU-8 maestro se compone de dos capas. Los microcanales 3-m de altura están fundidas en la capa primera / inferior antes en el proceso, mientras que las cámaras de 250 micras de altura de siembra y recibir son en la segunda capa / superior. A fin de que la conexión correcta entre dos compartimientos de cultivo (microcanals y cámaras), las dos capas tienen que ser alineados con precisión en la posición. Sin embargo, el grosor y la opacidad de la capa de segundo son lo suficientemente grandes como para bloquear el alineador fiducial / óptico de acceder a las características del fondo. Aquí diseñar las máscaras con los marcadores de referencia están en posición remota. Por lo tanto, estos marcadores en la primera capa puede ser selectivamente protegido mientras que hace girar la segunda capa. Como resultado, ambas capas de características se hacen en un maestro y listo para el moldeo en bajorrelieve del sello PDMS. <ol><li> Diseñar y preparar dos foto-máscaras. Una máscara se compone de dos marcadores de referencia y una serie de microcanales (400 micras de largo y de ancho 10-50 micras) para la primera capa. Otra máscara consta de siembra y cámaras de recepción (2 mm de largo y 600 micras) para la segunda capa. Ambas máscaras están diseñados en Illustrator (Adobe, California), impresa con impresora láser sobre películas de transparencia (piezas metálicas delgadas, Colorado), se limpiaron con isopropanol y se secó al aire. </li><li> Hacer la primera capa conSU-8 fotosensible (MicroChem, Massachusetts), según el manual de producto del proveedor. En primer lugar, spin-capa de la oblea de mango (Materiales WRS, California) con 3-micras de espesor de material fotorresistente SU-8 (5), seguido de suave-cocción. El material fotorresistente es entonces expuesto ultravioleta-y curarse con la máscara correspondiente en primer contacto, seguido de post-cocción y en desarrollo. </li><li> Spin-capa de la capa de segundo con 250 m de espesor su-8 (2100). Con el fin de evitar fotorresistente gruesa de bloqueo de los marcadores de referencia de la primera capa, que cubrir estas áreas con cinta adhesiva en antes de recubrimiento por rotación de la segunda capa. La cinta se despega para revelar los marcadores para fines de alineación. </li><li> UV-exponer la capa de segundo con la segunda máscara. Con los marcadores de alineación reveló, es sencillo para alinearlos a los de la segunda máscara usando alineador de máscara óptica. La segunda capa de material fotorresistente es entonces ultravioleta expuesto y curado en primer contacto, seguido de post-cocción y en desarrollo. &lt;/ Li&gt; <li> Lucha contra el palo de la capa del maestro resultado. Para ayudar en la eliminación de curado PDMS, el SU-8 maestro puede silanizada a través de la deposición de vapor para hacer la superficie de un revestimiento antiadherente de tipo. Simplemente colóquelo en un desecador durante al menos una hora, con varias gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) solución de silano al vacío. </li><li> Moho PDMS con el maestro. Mezcla de base y endurecedor de prepolímero PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) en relación 10:1 a fondo. Colóquelo en un desecador para desgasificación al vacío hasta que no queden burbujas de aire que se ve. Verter la mezcla en la máscara y desgasificar de nuevo si nueva burbuja de aire se introduce. Curar el molde sobre una placa calefactora nivel durante 2 horas a 90 º C. Después de enfriarse a temperatura ambiente, suavemente liberar el sello de PDMS. Por lo tanto, los canales están grabados en el cultivo de PDMS y listo para el montaje de dispositivo. El maestro es reutilizable para el moldeo hasta que esté agrietado o desgastado. El revestimiento antiadherente tiene que realizarse de nuevo cuando la pegajosidad recupera. </li></ol> 3.Montaje de los dispositivos de microfluidos y cultivo celular (figura 2) Con el fin de células de cultivo, característica grabado con sello PDMS está unido a un cubreobjetos de vidrio para formar canales cerrados. Las entradas y salidas son creados para la carga de la cultura / media. Mientras tanto, la limpieza y otros procedimientos para el sustrato de vidrio y el sello PDMS son necesarias para garantizar la compatibilidad celular. <ol><li> Hacer depósitos a través del sello PDMS con golpeador biopsia agujero. Elegimos a su diámetro será de 6 mm. Estos depósitos sirven para dos propósitos. Uno es mantener nutriente extra para el crecimiento celular. El otro es para el acceso de la carga de la pipeta y la aspiración al vacío. </li><li> Remojar el sello de PDMS en 70% de etanol durante 30 min y luego se enjuaga con agua desionizada durante otros 10 min. El objetivo es eliminar los posibles residuos orgánicos introducidos durante el proceso de fabricación, y sin reticular contaminación PDMS. Más intensas y exhaustivas procesos de limpieza, tales como la extracción orgánica 13 </sup&gt; Y extracción Soxhlet 14 se utilizaron en otra parte. Sin embargo, encontramos que no es necesario en la cultura BTSC. </li><li> Esterilizar el sello PDMS utilizando autoclave (121 ° C, 35 min). Este paso completa la reacción de reticulación de PDMS. A partir de este paso y hasta el paso 3,6, todos los procedimientos se toman en forma estéril. </li><li> El sello de PDMS se coloca luego sobre un cubreobjetos de vidrio, la cual es previamente revestida con poli-L-lisina. 15-17 El dispositivo se recubre entonces con laminina llenando el canal con solución de laminina durante la noche a 37 ° C. La laminina es aspirado desde el dispositivo y el dispositivo se lavaron con medio de células madre. </li><li> Cargar suspensión de células a partir del paso 1 en embalses y canales. 11 l de células disociadas se coloca en el depósito de siembra uno. La aspiración por vacío se utiliza para forzar las células en la cámara de la siembra, si es necesario. Un adicional de 7 l de células se colocan al lado del depósito de siembra. Nota: la densidad media celda es de 20.000 células / medios mu l. En popaer cinco minutos, la siembra y embalses que reciben se inundan con los medios de comunicación. </li><li> Coloque un 0.5-1 mm pre-tratada en autoclave hoja PDMS en la parte superior. La adhesión a la superficie de forma natural se produjo entre dos piezas de PDMS hará que el cultivo de células de sellado y listo para el transporte, la incubación y de imágenes microscópicas. </li></ol> 4. A largo plazo time-lapse de imágenes de BTSC migración con BioStation IM (Nikon Instruments Inc., Melville, EE.UU.). La combinación de cámara, software y todo incubadora, en un cuadro, este sistema microscópico permite cultura de la imagen celda sin perturbación por día. Además, su diseño único motor mueve la lente objetivo y mantiene fase estacionaria muestra en la característica de punto de visita. Esto hace que sea práctico para experimentos de imágenes en paralelo y la locomoción celular pista de ensayo de alto rendimiento. <ol><li> Pre-equilibrar el IM BioStation durante 45 minutos para estabilizar el suministro de la temperatura, la humedad y el aire. Además de varios agua-contobjetivó platos en la cámara de muestra se utiliza para mantener la humedad adecuada. </li><li> Cargue el dispositivo celular-contenido en la cámara de muestras del microscopio, y centrarlo con unas pinzas micro. </li><li> Establecer el enfoque, la posición de puntos y los puntos temporales en software BioStation e iniciar el lapso de tiempo. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Ejemplos de inspección visual y caracterización de la migración de las células cancerosas mediante el uso de un dispositivo de microfluidos en compartimientos se ilustran en la Figura 3 y la Figura 4. La línea celular es BTSC. Con nuestra configuración actual, las imágenes de fase de cultivo celular se puede registran continuamente durante el tiempo que 5 días (Figura 3) y tan frecuente como cada 2 segundos (Figura 4). Más allá de 5 días, los medios de cultivo deben ser reemplazados por la reposición de nutrientes y retirada de desechos. Nuestro largo plazo de lapso de tiempo identifica una secuencia rotatorio de seis etapas celulares durante su migración basado en los cambios morfológicos. Como se ilustratrado en la figura 3, se los describe como (i) antes de la migración, (ii) el inicio, (iii) la trayectoria de exploración, (iv) de crucero, (v) destino exloration y (vi) después de la migración. En la cámara de recepción, en forma de huso células permanecen en la etapa (i) como en los tumores a granel que son capaces de crecer, dividirse y migrar gradualmente. Cuando se acercan a la entrada del microcanal, unas pocas células proceder a la etapa (ii) cuando se expanden y generan saliente adhesivo. Sólo uno de ellos es capaz de ocupar la entrada y proceder a la etapa (iii), el cual puede explorar la dirección de migración. Una vez que la célula determina la dirección de la migración, se procede a la etapa (iv) para navegar a través del microcanal en una velocidad constante y alta, que se lleva a través de todo el microcanal. Al final del producto microcanal, células de la etapa (v) para explorar el espacio abierto de la cámara de recepción, y luego a la etapa (vi). En microcanal, poder migrar es principalmente generada por blebbing actividad como se ilustra en la figura 4, similar a la de ameboide cell. Formación de ampollas en la membrana celular y la deformación están totalmente grabada aquí. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema de fabricación del dispositivo de microfluidos. El proceso se lleva sobre una oblea de silicio 3-pulgadas mango a través de una técnica modificada de litografía blanda. 3-m de altura microcanales y marcadores de alineación se hacen como en la primera capa. Luego de 250 micras de espesor SU-8 es spin-revestido, mientras que los marcadores de alineación están cubiertos con cinta adhesiva, de modo que más tarde puede ser accesible para enmascarar alineador sin visión de bloqueo por fotorresistente gruesa. Por lo tanto, las características de la cámara se pueden hacer como la segunda capa y alineado con precisión a la primera capa. Sello PDMS es finalmente moldeada fuera el maestro resultante. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema de montaje del dispositivo y proceso de la siembra de células. Rodeada por PDMS y glcubreobjetos culo, el espacio de cultivo 3D se compone de cámaras, reservorios y microcanales. La cámara se llena con la siembra de cultivo de células, mientras que la cámara de recepción se llena inicialmente con medios libres de células. Los microcanales que se conectan entre ellos proporcionar rastro célula en migración de lado a lado receptor de la siembra. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. BTSC migración a través de microcanales. Alto: instantáneas de lapso de tiempo muestran una sola célula (resaltado en verde) migra sobre 400 micras desde el lado de la siembra para el lado de recepción. El viaje completo dura aproximadamente 2 días, que implica una serie de cambios morfológicos celulares. La barra de escala es de 40 m. Bajar: una representación de la historieta de seis etapas de migración. Previo a la migración (i): En cámara de siembra, las células en forma de huso y divisible se desplazan gradualmente a lo largo de la otra. Las células cerca de raza entrada de microcanal con cada otro por polarizante cuerpo celular y correo<html> xerting saliente lamellipodia. Iniciación (ii): La célula migratoria con la más alta capacidad ocupa la entrada del canal, mientras que sus competidores van a retirarse. Ruta de exploración (iii): Los cambios en las células migratorias a un modo ameboide con polaridad. Este modo de migración es extremadamente móvil y capaz de explorar ruta de acceso en todas las direcciones por pequeñas protuberancias blebbing de membrana. Crucero (iv): Una vez que la ruta de migración se determina, la célula se transforma en un modo ameboide adaptada por el mantenimiento de un saliente adicional gran partida hacia delante. De esta manera, la célula mantiene una alta motilidad así como una dirección y velocidad constantes. Destino de exploración (v): Al final del camino, la célula se ralentiza y se desarrolla filopodias para explorar la cámara de recepción para cualquier objetivo invasión. Después de la migración (vi): Después de entrar en la cámara de recepción, célula se convierte en forma de estrella y retiene la motilidad alta, pero sin dirección determinada. &quot;/&gt; . Instantáneas de la figura 4 del lapso de tiempo muestran el ciclo de deformación blebbing actividad y la membrana de un BTSC: (AB). iniciación; (BD). Expansión; (DF). La retracción. Las flechas y las líneas de curva-representan la dirección y localización de la deformación de membrana, respectivamente. Las instantáneas se capturan cada 8 segundos.

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No hay conflictos de interés declarado.

El dispositivo microfluídico y la técnica de registro de imagen que aquí se presenta permite una caracterización visual de la morfología celular durante la migración. En comparación con los métodos convencionales existentes, la plataforma de microfluidos ofrece ventajas de coste-eficacia, alto rendimiento y flexibilidad de diseño. El sistema presentado visualización microscópica permite el estudio de grabación y de migración a largo plazo de células vivas. La característica de lente motorizado hace posible el seguimiento de múltiples rutas de migración en una imagen de alta resolución sin perturbar la muestra. Durante el montaje del dispositivo, el sello de PDMS no es unida permanentemente a la cubreobjetos de vidrio para la conveniencia del revestimiento PDL (paso 3,4). Es fundamental para lograr un buen sello para el éxito de este protocolo. Contaminación introducida desde la fabricación del dispositivo, tales como burbujas de aire en el sello o el polvo / suciedad en el sustrato, puede poner en peligro la unión y resultar en pérdida de líquido. Por lo tanto, TREATIng el dispositivo de una forma libre de polvo es importante para evitar fallos del dispositivo. Antes de la PDL-recubrimiento, los cubreobjetos de vidrio son el ácido nítrico y de la lejía PDL se centrifuga para eliminar el polvo / residuos. Nos encontramos con cinta Scotch, enjuague con alcohol, y baño de agua muy útil en la eliminación de polvo / desechos desde el sello PDMS, si una habitación limpia no es accesible. Después de que el sello de PDMS hacer contacto con el cubreobjetos de vidrio, tocando el sello suavemente con pinzas facilita el sello. BTSCs puede enriquecerse a partir de especímenes humanos sala de operaciones a través de la cultura esfera en medio de las células madre, similar a la cultura normal de las células madre neuronales 10. BTSCs enriquecidos de esta manera demostrar células madre similares a las propiedades, tales como la expresión de marcadores de células madre (CD133, nestina), la diferenciación a múltiples linajes neuronales (glial y neuronal), y la iniciación del tumor en un modelo de ratón inmunodeficiente ortotópico con tan pocos como 100 células 18. A pesar de un cierto discusión existe sobre purificatión y el mantenimiento de BTSCs 1, 19-21, crecido esfera-BTSCs mejor mantener el fenotipo y el genotipo del tumor parental 22-24. El espacio compartimentado imita el entorno fisiológico para la migración celular. En nuestro dispositivo, BTSC exhiben una fuerte capacidad de migración a través de un espacio de tamaño restringido mediante la regulación de la morfología celular. Nuestra caracterización de los cambios morfológicos celulares indica el modo de transformaciones-en una secuencia de seis etapas que se pueden modelar una posible nueva descripción detallada de la invasión de BTSC cerebral adyacente. En las primeras etapas, las células ganar una cantidad significativa de la polaridad y generar protuberancias adhesivas para anclarse eficazmente dentro del microcanal. Una vez que la ocupación de las células del microcanal se establece, se convierte en un modo de crucero y mantiene este modo durante todo el viaje a través de un micro. En esta etapa, BTSC mantener la motilidad alta y dirección consistente pero conservar la energía. Enterestingly, parece que microcanal uno está limitado a células de crucero de uno en uno, de tal manera que cuando un producto de células individuales a esta etapa, se retiran células de otro desde el microcanal. Este mecanismo asegura la eficacia probable de diseminación tumoral y previene el consumo excesivo de nutrientes en microcanal. Después de completar la migración a través del microcanal, una célula recupera su propensión a protuberancias multidireccionales y una mayor exploración de blancos de la invasión o caminos nuevos de migración. El dispositivo de microfluidos en compartimientos ofrece un novedoso in vitro significa de crear un microambiente para el estudio de la infiltración BTSC de parénquima cerebral. Este método puede ser fácilmente adaptado para el estudio de células madre de cáncer (CSC) y líneas migratorias de células derivadas de otros tipos de tumores. El cultivo de células en el dispositivo microfluídico puede realizarse en cualquier laboratorio de biología moderna que está equipada con una incubadora de cultivo de tejidos y experiencia. Equipado con un su maestro-8, PDMSfundición y montaje del dispositivo sean factibles con algún tipo de formación fundamental en la litografía blanda. Además, esta plataforma puede extenderse también para otras aplicaciones con la integración de otros módulos funcionales, tales como mezclador de gradiente, los patrones de superficie, control de fluidos y microelectrodos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Dulbecco modificado a medio Eagle (DMEM), la glucosa alta </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> F12 de Ham </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Suplemento B27 menos vitamina A </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), humano recombinante </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Factor crecimiento fibroblasto básico (bFGF), humano recombinante </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Sal sódica de heparina, a partir de mucosa intestinal porcina </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> La laminina (ratón natural) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Tumor cerebral de células madre (BTSC) Suministros cultura </td></tr><tr><td> Stem medio celular </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% Hams F12 </li><li> 70% de DMEM </li><li> 1% de antibiótico-antimicótico </li><li> 2% B27 sin vitamina A </li><li> De EGF (20 ng / ml) y bFGF / heparina (20 ng/ Ml de bFGF, 5 mg / ml de heparina) Mezclar los ingredientes y el filtro estéril antes del uso </li></ul></td></tr><tr><td> Factor crecimiento fibroblasto básico (bFGF) / Heparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Alícuota de concentración 20 mg / ml </li><li> Para 25 mg: Añadir 1,25 ml de heparina bFGF 5mg/ml a 25 mg. </li><li> Por 250 g: Añadir 1 ml de heparina bFGF g 5mg/ml a 250. Traslado al cónico de 15 ml y añadir 11,5 ml de 5 mg / ml de heparina para cónica. </li><li> Tienda un 50 o 250 l alícuotas a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Alícuota de concentración 20 mg / ml </li><li> Por 200 g: Añadir 1 mL estéril DMEM (Gibco 11965-118) a EGF mg 200. Traslado al cónico de 15 ml y añadir 9 ml de DMEM. </li><li> Por 500 g: Añadir 1 mL estéril DMEM (Gibco 11965-118) a EGF mg 200. Traslado al cónico de 50 ml y añadir 24 ml de DMEM. <li> Guarde un 50 y mu; L o 250 ml de alícuotas a -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> La heparina </td><td></td><td></td><td><ul><li> Alícuota de concentración 5 mg / ml </li><li> Pesar 100 mg de heparina. </li><li> Añadir 100 mg de heparina a 20 ml (70%) DMEM-(30%) F12-(1%) PSA (14 ml DMEM, F12 6 ml, 200 l PSA) </li><li> Filtro estéril </li><li> Tienda un 50 o 250 l alícuotas a -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> SU-8 fotoprotector </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Obleas de silicio mango </td><td> WRS Materiales </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> laminina </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 g /ml en tampón PBS para la concentración final </td></tr><tr><td> BioStation IM </td><td> Nikon instrumentos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

En los últimos 40 años, Estados Unidos invirtió más de 200 millones de dólares en la investigación del cáncer, lo que resulta en sólo una disminución del 5% en el índice de mortalidad. Un obstáculo importante para mejorar los resultados del paciente es la escasa comprensión de los mecanismos subyacentes a la migración celular asociada con la célula de cáncer agresivo invasión, metástasis y resistencia terapéutica 1. El glioblastoma multiforme (GBM), el más frecuente del tumor primario maligno cerebro adulto 2, es un ejemplo de esta dificultad. A pesar de la cirugía estándar de radiación y la quimioterapia, la mediana de supervivencia del paciente está a sólo quince meses, debido a la infiltración GBM agresivo en el cerebro adyacente y la recurrencia de cáncer de rápido 2. Las interacciones de los mecanismos celulares aberrantes migratorias y el microambiente tumoral probable diferenciar el cáncer de las células normales 3. Por lo tanto, la mejora de los enfoques terapéuticos para el GBM requerirá una mejor comprensión de los mecanismos del cáncer de la migración celular. El trabajo reciente sugiere THAta subpoblación pequeña de células dentro de GBM, el tumor cerebral de células madre (BTSC), puede ser responsable de la resistencia terapéutica y la recurrencia. Los mecanismos que subyacen a la capacidad migratoria BTSC sólo están empezando a ser 1,4 caracterizados. Debido a una limitación en la inspección visual y la manipulación geométrica, los ensayos de migración convencionales 5 están restringidos a la cuantificación de las poblaciones totales de células. En contraste, los dispositivos de microfluidos permitir el análisis sola célula debido a la compatibilidad con microscopía moderna y el control de micro-entorno de 6-9. Se presenta un método para la caracterización detallada de la migración BTSC compartimentalización mediante dispositivos de microfluidos. Estos dispositivos PDMS-hechas emitir el ambiente de cultivo de tejidos en tres compartimentos conectados: siembra de cámara, cámara de recepción y reducir microcanales. Hemos adaptado el dispositivo de forma que las dos cámaras mantener medios suficientes para apoyar BTSC viable para 4-5 days sin medio de cambio. BTSCs altamente móviles inicialmente introducidos en la cámara de siembra se aíslan después de la migración aunque puente microcanales paralelos a la cámara receptora. Esta migración simula cáncer de propagación celular a través de los espacios intersticiales del cerebro. Las imágenes en directo de la fase morfología celular durante la migración se registran durante varios días. BTSC altamente migratorias por lo tanto, puede ser aislado, volvieron a cultivar, y analizado. Microfluídica compartimentar puede ser una plataforma versátil para estudiar el comportamiento migratorio de BTSCs y otras células madre del cáncer. Mediante la combinación de generadores de gradiente, la conducción de fluidos, micro-electrodos y otros módulos microfluídicos, estos dispositivos también se pueden utilizar para la detección de drogas y diagnóstico de la enfermedad 6. El aislamiento de una subpoblación de células migratorias agresivo permitan estudiar mecanismos moleculares subyacentes.

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Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Un dispositivo de microfluidos en compartimientos para la investigación de la migración de células madre del cáncer se describe. Esta novedosa plataforma crea un microambiente celular viable y permite la visualización microscópica de locomoción de células vivas. Muy móviles células cancerosas se limitan a estudiar los mecanismos moleculares de la infiltración agresivo, que puede conducir a terapias más eficaces en el futuro.

Evaluación de la migración de las células madre del cáncer compartimentar Utilizando dispositivos de microfluidos y imágenes de células vivas

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K vistas.  University of Wisconsin-Madison. Un dispositivo de microfluidos en compartimientos para la investigación de la migración de células madre del cáncer se describe. Esta novedosa plataforma crea un microambiente celular viable y permite la visualización microscópica de locomoción de células vivas. Muy móviles células cancerosas se limitan a estudiar los mecanismos moleculares de la infiltración agresivo, que puede conducir a terapias más eficaces en el futuro.

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Investigación

Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelos de 4D Live de células de imagen de un tumor: Interacciones microambiente que la progresión maligna del impacto

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Dimensional resina de moldeo e Imagen de la vena portal del ratón o Sistema vías biliares intrahepáticas

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos