El modelo de ratón empleado en este estudio simula eficazmente el efecto de la ingestión crónica de nicotina y la exposición repetida a la sílice sobre las fibrosis pulmonares a través de la transición epitelial mesenquimal en seres humanos. El modelo de porción de jurado se logró mediante la inyección subcutánea de nicotina y el goteo nasal de sílice de una manera simple y confiable. Suspenda sílice cristalina estéril en solución salina para preparar una suspensión de 20 miligramos por litro.
Oscilar en un baño de agua agitado por ultrasonidos durante 25 minutos. Coloque la suspensión de sílice con un oscilador de vórtice durante tres minutos. Aspire la suspensión para mezclarla y luego use 50 microlitros para el goteo nasal.
Para comenzar la exposición a la sílice, primero, coloque el ratón anestesiado en la palma de una mano y exponga la cavidad nasal del ratón. Inyecte 50 microlitros de la suspensión de sílice de una fosa nasal en un plazo de cuatro a ocho segundos. Para permitir una rápida penetración pulmonar de la suspensión, presione suavemente el pecho del ratón con el dedo índice durante tres a cinco segundos, repitiendo la pulsación de tres a cinco veces por segundo para mantener su frecuencia respiratoria.
Una vez que el ratón muestre una respiración uniforme, colóquelo bajo observación en una jaula durante tres minutos. Prepare las jeringas de nicotina aspirando aire hasta la marca de 0,2 mililitros en una jeringa de un mililitro. A continuación, extrae 125 microlitros de nicotina.
Golpee la jeringa para llenar la aguja y la parte delantera con nicotina, y luego colóquela en una bandeja protegida de la luz. Con la mano derecha, agarra la cola del ratón. Cuando el ratón se haya relajado, utilice el pulgar y el índice izquierdos para aplicar una presión moderada sobre la piel desde la cola hasta el borde de la oreja.
Ahora, suelta la mano derecha y usa los dedos izquierdo, pequeño y anular para pellizcar la cola y las extremidades traseras para inmovilizar al ratón. Sostenga la jeringa de inyección en la mano derecha y perfore la piel de la parte posterior del cuello en dirección de la cabeza a la cola. Inyecte la nicotina a una velocidad uniforme.
Fije el ratón anestesiado en una placa de prueba de espuma y rocíe el pelaje con alcohol al 75%. Haga una incisión a lo largo de la línea media del abdomen exponiendo la cavidad torácica. Haz una pequeña incisión en el vértice del lado derecho del corazón.
Inyecte 20 mililitros de PBS preenfriado lenta y uniformemente desde el ápice del corazón izquierdo, haciendo que la sangre fluya hacia afuera por la abertura creada en el ápice del corazón derecho. Retire todo el lóbulo pulmonar y refrigérelo a menos 80 grados centígrados. Perfundir los ratones restantes con 10 mililitros de paraformaldehído al 4%.
Después de la perfusión de PBS, conservar los pulmones en 30 mililitros de la solución de paraformaldehído. Después de 72 horas, sumerja los pulmones en el fijador preparado y colóquelos en un baño de agua ultrasónico. Templado a 40 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, realice la deshidratación colocando el tejido en etanol al 75%, luego en etanol al 95% y luego en etanol anhidro durante 50 minutos cada uno. Sumerja el tejido pulmonar en xileno durante 50 minutos dos veces para lavar el tejido. Coloque el pañuelo en cera de parafina derretida durante dos o tres horas a 55 a 60 grados centígrados.
Una vez que la cera se haya endurecido, utilice una máquina seccionadora para obtener los cortes de pulmón de cuatro a cinco micrómetros de espesor. Calentar las secciones a 45 grados centígrados en agua ultrapura. Coloque las secciones de pulmón en un portaobjetos de microscopio adherente una vez que la cera se derrita.
Los estudios de tinción de hematoxilina y eosina mostraron que los ratones expuestos a la nicotina combinada con sílice tenían un daño pulmonar significativamente más grave que los expuestos a la nicotina o a la sílice sola. La tinción de Masson reveló un aumento de la deposición de fibras de colágeno en los pulmones expuestos a la combinación de sílice de nicotina en relación con los otros grupos. Las estructuras alveolares fueron destruidas en los ratones expuestos a sílice.
Los estudios inmunohistoquímicos revelaron un aumento de los macrófagos CD dos cero seis positivos y del factor profibrótico, células positivas TGF beta uno en los ratones expuestos a la combinación de nicotina y sílice. La expresión de vimentina fue mayor en los ratones sometidos a la expresión dual en relación con los otros grupos. Los estudios inmunohistoquímicos y la cuantificación de proteínas sugieren una grave transformación epitelial mesenquimatosa.
Para garantizar el éxito de la inyección de nicotina, el operador debe familiarizarse con el agarre de los ratones, ya que agarrar la piel de la parte posterior del cuello podría ser doloroso para ellos.
