Este protocolo utiliza tres enfoques para determinar si el humo del cigarrillo afecta la carga bacteriana pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este método se puede expandir a celdas endoteliales u otros grifos de celda. La preparación de la extracción de humo de cigarrillo, la infección bacteriana y la determinación con una carga bacteriana están bien descritas en detalle en este video.
Este procedimiento es muy fácil de seguir para los nuevos usuarios. Dibuje 10 mililitros de medio de cultivo celular libre de suero en una jeringa de 60 mililitros. Fije el extremo estrecho de un borde a la punta de la pipeta de un mililitro a la boquilla de la jeringa, como adaptador para sujetar el cigarrillo.
Retire el filtro del cigarrillo y conecte el cigarrillo al adaptador. No más de 30 minutos antes de realizar el ensayo peina el cigarrillo y extrae 40 mililitros de humo que contenga aire en la jeringa. Mezclar el humo con el medio agitando la jeringa vigorosamente.
Repita el proceso de dibujo hasta que el cigarrillo se queme por completo, lo que requerirá unos 11 sorteos en aproximadamente siete minutos. Para eliminar microorganismos y partículas insolubles del medio, filtre a través de un filtro de 0,22 micras. A continuación, transfiera el medio a un tubo estéril cerrado.
Inocular un caldo de soja tríptico o un plato de barrena TSB con una cepa de pseudomonas seleccionada. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Preparar un tubo que contenga 20 mililitros de TSB con 5% de glicerol como fuente de carbono.
Recoger un frotis de la placa de barrena e inocular el TSB. Incubar la suspensión de pseudomonas en un agitador de 37 grados Celsius a 200 RPM, durante aproximadamente una hora, hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea 0,6. Después de cultivar células epiteliales pulmonares como se describe en el manuscrito, agregue un mililitro de 0.25%trypsin a las células.
Después de aproximadamente cinco minutos, cuando las células se hayan separado completamente de la parte inferior de la placa, agregue 10 mililitros de medio Alturas completo para neutralizar la trippsina. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Luego, centrifuga las células durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y 300 veces G.Retire y deseche el sobrenadante.
Luego, vuelva a suspender las células en mililitros de alturas medio con 10%FBS. Pipetear 10 microlitros de la suspensión de la célula epitelial en una placa nueva. Utilice un contador de células automatizado para obtener la concentración celular.
Placar las células epiteliales pulmonares a una concentración de tres veces 10 a las quintas células por mililitro, en un volumen total de dos mililitros de medio por pozo. Incubar los platos durante la noche. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80%confluencia, reemplace el medio por el medio Alturas, más 1%FBS.
A continuación, añadir 4%CSE a los pozos e incubar las placas durante tres horas. Agregue una pseudomonas a cada pozo de células epiteliales pulmonares tratadas con CSE. Luego, incuba las placas durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
A continuación, reemplace el medio en las seis placas de pozo por dos mililitros de nuevo medio Heights, que contiene 4%CSE y 100 microgramos por mililitro de gentamicina. Después de incubar las placas durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, aspirar el medio de los pozos. Lave dos veces las células tratadas con gentamicina con dos mililitros de PBS frío.
La carga de bacterias en las células epiteliales pulmonares se puede detectar mediante el método de placa de caída, qRT-PCR o citometría de flujo. Añadir un mililitro de tampón de lisis celular a cada pozo de células epiteliales pulmonares. Reparar diluciones en serie del lysate celular, que van del uno al 10 al uno a 10.000.
A continuación, inocular la placa de sinfín de TSB. Después de 16 horas de incubación, determinar cuántas unidades formadoras de colonias estaban presentes en las células epiteliales pulmonares, contando el número de colonias bacterianas. Añadir 0,35 mililitros del tampón de lisis de tiocianato de guanidinio a cada pozo de células epiteliales pulmonares.
Recoger las células con un rascador de células. Pipetear el licate en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente con la pipeta. Añadir 0,35 mililitros de recién preparados al 70% de etanol al izado y mezclar bien.
Transfiera todas las muestras a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de dos mililitros. Centrifugar el tubo de recogida durante 30 segundos a 10.000 veces G y 20 a 25 grados centígrados. Deseche el tampón en el tubo de recogida y lave la columna con 0,7 mililitros de tampón de lavado.
Centrifugar la columna a 10.000 veces G durante 30 segundos. Lave la columna dos veces con 0,5 mililitros de tampón. Repita la centrifugación a 10.000 veces G durante dos minutos.
Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 1,5 mililitros y agregue de 30 a 50 microlitros de agua sin RNase. Después de centrifugar el tubo a 10.000 veces G durante un minuto, recoja el flujo a través y mida la concentración de ARN. Para prepararse para una reacción de transcripción inversa de 20 microlitros, hace que un microgramo de ARN total con 10 microlitros de tampón de reacción, un microlitro de transcriptasa inversa y agua libre de RNase.
Llevar a cabo la reacción de transcripción inversa a 37 grados Celsius durante una hora y luego a 95 grados Celsius durante cinco minutos, de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, mezcle un microlitros de cada muestra de ADNc con cinco microlitros de la mezcla maestra que contienen tinte cibernético y un microlitro de cada imprimación específica de 200 nanomolares. Añadir agua para un volumen total de 20 microlitros.
Realizar análisis de PCR, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Y luego utilice el método de TC comparativo para determinar la expresión. En las células BEAS-2B, la viabilidad no cambió considerablemente cuando las células fueron tratadas con 4%CSE durante tres horas.
Una hora como infección por pseudomonas tampoco afectó sustancialmente la viabilidad. Finalmente, utilizan la gentamicina para matar pseudomonas en el medio de cultivo no tuvieron un efecto estadísticamente significativo en la viabilidad celular. Según lo medido por el método de la placa de caída, la infección bacteriana en las células BEAS-2B se incrementó sustancialmente con el tratamiento con EEB.
Lo mismo ocurre con el tratamiento de la CSE de HSAEC. La infección bacteriana de las células BEAS-2B tratadas con EEB también se evaluó mediante el uso de RT-PCR para cuantificar la cantidad de ARN 16S presente, lo que indicó un aumento de Pseudomonas aeruginosa. Las células BEAS-2B tratadas con CSE e infectadas con Pseudomonas fluorescens Migula fueron analizadas por citometría de flujo a 509 nanómetros.
El resultado también indicó que el tratamiento con EEB aumenta la infección bacteriana. Los resultados de la microscopía fluorescente mostraron que las bacterias etiquetadas por GFP co-localizadas con células BEAS-2B en un experimento de infección de Pseudomonas fluorescens Migula. Las células podrían estar expuestas al humo del cigarrillo con robots fumando, lo que puede imitar el comportamiento humano y hacer posible estudiar directamente los efectos del humo del cigarrillo en las células epiteliales pulmonares.
Esta técnica podría utilizarse para explorar un humo de cigarrillo en otros grifos celulares en el contexto de una infección pulmonar. El enfoque descrito para ser la base para el desarrollo de terapias efectivas contra una lesión pulmonar dorsal fumadora de cigarrillos y C0PD extra
