Este trabajo fue financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates Foundation (Gran Desafío Exploración premio a SBG), el Instituto Nacional para la Investigación en Salud (NIHR), el Centro de Investigación Biomédica en Enfermedades microbianas, y la Red de Investigación NIHR Integral Local. Queremos agradecer el apoyo de infraestructura para NWDA. Damos las gracias al Prof. J. Weiser N, de la Universidad de Pennsylvania y el Prof. P Hermans, de la Universidad de Nijmegen en los aislamientos de neumococo. Gracias al Comité de Seguridad EHPC por su apoyo y asesoramiento, a todos nuestros voluntarios por su participación y Mathieu Bangert para tomar las fotos.

1. Voluntarios de Selección y Evaluación <ol><li> Los voluntarios sanos son reclutados a través de anuncios y carteles en la web de la Universidad de acuerdo con la investigación del NHS y la orientación del Comité de Ética. </li><li> Los criterios de inclusión para la participación son: <ol><li> Los adultos de 18-60 años. </li><li> Habla con fluidez Inglés y es capaz de comunicarse con facilidad tanto por teléfono móvil y mensajes de texto. </li></ol></li><li> Los criterios de exclusión de participación son las siguientes: <ol><li> El contacto estrecho con individuos en riesgo (niños, adultos inmunosuprimidos, la salud ancianos, enfermos crónicos). </li><li> Actual fumador o significativa historia de tabaquismo (&gt; 10 paquetes). </li><li> El asma u otras enfermedades respiratorias. </li><li> Embarazo. </li><li> La alergia a la penicilina o amoxicilina. </li><li> Participación actual en otro ensayo clínico observacional o menos en la no-intervencionista fase. </li><li> Incapaz de dar un consentimiento plenamente informado. </li></ol></li><li>Una visita de selección inicial, aproximadamente una semana antes de la inoculación, incluye una historia clínica y exploración enfocada clínicas específicas. </li><li> Si previamente no reconocido se encuentra algo anormal, el voluntario será excluido del estudio y la investigación correspondiente se organizarán a través de la atención primaria. </li><li> Durante el cribado inicial visitar un conteo sanguíneo completo se obtiene para asegurar que el recuento de glóbulos blancos está dentro del rango normal antes de la visita de la inoculación. Un lavado nasal se realiza para excluir portadores naturales de neumococo (ver 6.1). </li><li> Antes de la inoculación, los voluntarios están educados sobre los riesgos que implica la participación en el estudio y se les proporciona un prospecto de emergencia, termómetro digital, teléfonos de emergencia y 3 días de curso de la amoxicilina. </li></ol> 2. Preparación de las poblaciones de inoculación <ol><li> Preparación de las poblaciones de inoculación debe realizarse en un ambiente limpio. Las pipetas usadas sólo se deben utilizard para la preparación del inóculo. Todo el vidrio y artículos de plástico deben ser estériles. Se recomienda que las poblaciones de inoculación se preparó en una sala específica, utilizando una campana de humos y dedicado incubadora. </li><li> Cepas neumocócicas se inocularon en una placa de agar sangre. Las placas se incubaron a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. El día después de que todas las bacterias se rasparon de la placa de agar sangre y se inocularon en un sistema de stock preservación talón. Se trata de poblaciones de cuentas se utilizan para la preparación de la inoculación de valores. Prueba de los stocks de perlas para la contaminación y la uniformidad colonia antes de preparar un stock de inoculación. </li><li> Para preparar el stock de la inoculación, inocular una placa de agar sangre con dos talones de la serotipo deseado Imágenes neumocócica talón, en estrías para cubrir toda la placa. Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. Todas las incubaciones posteriores se utilizan estas mismas condiciones. También se incuban los medios de comunicación Vegitone durante la noche para garantizar la esterilidad. </li><li> El hisopo mañana siguientela mitad de la placa, no teniendo cuidado de eliminar cualquier agar sangre, y añadir a 12 ml de caldo Vegitone pre-calentado. Repita con la otra mitad de la placa. Agregar los dos viales de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas o hasta que un cambio en la turbidez se hace evidente, lo que ocurra primero. </li><li> Añadir los 12 ml a 40 ml de caldo Vegitone pre-calentado y mezclar bien. Repita para el otro 12 ml frasco. Este es el punto de tiempo = 0. Eliminar 100 l para leer la densidad óptica (DO) a 600 nm. Eliminar 20 l para la cuantificación de las bacterias a la unidad formadora de colonias (CFU) recuento utilizando una variación del método de Miles y Misra (M &amp; M) 7. Incubar ambos viales. <ol><li> Para el M &amp; M, dividir una placa de agar sangre en seis secciones. Añadir 180 l de PBS estéril a seis pocillos de una placa de 96 pocillos (de fondo en U). Añadir 20 l de caldo a la parte superior del pozo y mezclar. Diluciones seriadas de las muestras 1:10 en seis ocasiones y descartar 20 l del pozo sexto. Coloque tres gotas 10 mu l de la parte superior del pozo en la sección primera de laplaca de agar sangre. Repita el procedimiento para los cinco otros pozos. Asegúrese de que la placa está seca antes de que se invirtieron y se incubaron. </li><li> Al día siguiente, contar el número de colonias visibles en cada sección de dilución y el registro. Usando la sección de dilución con un recuento de entre 30 y 300, se divide el número de colonias visibles por tres para obtener una media. </li><li> Multiplicar el número medio de colonias por el factor de dilución y se divide por 10 (la cantidad de la caída de 10 l). Esto da UFC / l. </li><li> Multiplique este número por 1.000 para obtener UFC / ml. </li></ol></li><li> Realizar lecturas de DO 600 y cuantificación de bacterias por M &amp; M método cada hora hasta principios de fase semilogarítmica se alcanza una DO de 0,25. </li><li> Una vez que se alcanza este OD, añadir glicerol esterilizado 10% a un vial y preparar alícuotas de 1 ml. Tienda de alícuotas a -80 ° C. </li><li> Para una acción más concentrada, centrifugar el otro vial en 3.345 xg durante 15 min y separar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 22,5 ml de Vegitone medio y agregar 10% de glicerol. Preparar alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C. </li><li> Deja existencias a -80 ° C durante al menos 48 horas antes de descongelar y cuantificar. </li><li> Cuantificar la población bacteriana congelado por el método M &amp; M. Pon a prueba tres tubos de valores de forma individual para asegurar la reproducibilidad. Utilizar el valor obtenido para diluir la acción a la concentración de inóculo deseada en solución salina, como se describe a continuación. </li><li> Para la inoculación, la cantidad de neumococos en el inóculo es calculado antes y después de la inoculación. Esta cuantificación de bacterias por el método de M &amp; M se utiliza para determinar el número medio de neumococos en el inóculo que representa el tiempo que tarda en completar todo el procedimiento. <ol><li> Preparar un inóculo, diluir a la concentración deseada, y llevar a cabo la cuantificación por el método de M &amp; M para el &quot;pre-inoculación&quot; recuento. </li><li> En nuestro Centro de Investigación Clínica que tarda el equipo de 30 minutos para completar el procedimiento de inoculación entero. Pneumococcal suspensiones en solución salina por lo general muestran una disminución en el recuento en este intervalo. Para dar cuenta de esto, deje encendido el inóculo diluido a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego realizar una &quot;post-inoculación&quot; cuantificación de las bacterias por el método M &amp; M. </li><li> Tomar el promedio de la antes y después para determinar la concentración final inoculado. Ajuste el &quot;sentadas&quot; tiempo de acuerdo con el protocolo clínico, pero mantener el intervalo tan breve como sea posible. </li></ol></li><li> Todos los stocks nuevos deben enviarse a un laboratorio de referencia para la confirmación de la pureza y la identidad de stock. </li></ol> 3. Preparación del inóculo <ol><li> Preparación del inóculo debe comenzar 30 min antes de la cita programada voluntario inoculación. </li><li> Tomar una de las trompas de valores previamente hechas de la -80 ° C congelador, se descongela y gire el tubo en la microcentrífuga a 17.000 xg durante 3 min. </li><li> Warm placas de agar sangre en la incubadora a 37 ° C. Prepararuna placa de 96 pocillos para la cuantificación bacteriana por el método de M &amp; M y preparar los tubos de dilución de acuerdo con la dosis deseada. </li><li> Quitar el sobrenadante del tubo de caldo centrifugado y resuspender el sedimento en 1 ml de solución salina. Este paso elimina el caldo del inóculo. </li><li> Repetir el paso de centrifugación. </li><li> Eliminar el sobrenadante salina y resuspender el sedimento en 1 ml de solución salina. </li><li> Realizar conjunto dilución de la concentración de inóculo deseado y cuantificar por M &amp; M método. </li><li> Tome el inóculo para la designación voluntaria y después de la inoculación de los voluntarios, repita la cuantificación en el laboratorio. Marque el tubo con la fecha y la dosis de inóculo y se almacena a -80 ° C. </li><li> Para garantizar la coherencia de la inoculación de la inoculación, es importante utilizar las mismas pipetas y equipo de laboratorio dedicado cada vez. </li></ol> 4. Inoculación <ol><li> Los voluntarios deben estar sentados cómodamente en una posición semi-reclinada. </li><li&gt; Con una pipeta estéril P200 y puntas con filtro elaborar 100 l de inóculo e inserte la punta justo en el interior de la cavidad nasal. </li><li> Lentamente expulsar el inóculo en la mucosa nasal con un movimiento circular. </li><li> Es crucial que la punta de la pipeta no entre en contacto con la mucosa nasal como una interrupción en la integridad del epitelio podría resultar en las bacterias que entran en el torrente sanguíneo. </li><li> También es vital que el inóculo no está demasiado lejos o se ejecutará en la garganta, sino que debe residir en el interior de la cavidad nasal. </li><li> Repita para el otro naris. </li><li> Haga que el voluntario permanezca en la posición semi-sentado por 10 minutos sin aspirar o soplar por la nariz. Esto permite tiempo para que las bacterias se dispersan a través de la mucosa. </li></ol> 5. Monitoreo <ol><li> Los voluntarios son supervisados ​​diariamente después de la inoculación. Esto incluye un mensaje de texto enviado por el diario voluntario a los investigadores antes de las 2 pm. </li><li> Si el texto is no ha recibido de las 2 pm el voluntario será contactado para asegurar su / su bienestar. Si él / ella no responde, el próximo asignado familiares serán contactados para asegurar el voluntario de bienestar. </li><li> Los voluntarios se les pidió que informaran sobre cualquier síntomas del tracto respiratorio superior en cada cita. El personal clínico le pedirá al voluntario para describir sus / sus síntomas y realizará un seguimiento de las denuncias. </li><li> Los antibióticos administrados a los voluntarios sólo deben tomarse bajo tres circunstancias: en caso de que no se sienten bien y tienen instrucciones de llevarlos por el equipo de investigación, si llevan neumococo al final del estudio, o si no se sienten bien y no puede comunicarse con el equipo de investigación. El voluntario se le anima a mantener este paquete de emergencia con ellos en todo momento durante el estudio y está en contacto con el equipo de investigación sobre una base diaria para los próximos 7 días. </li><li> Nuestro equipo está disponible 24/7 con contactos enfermera durante las horas de trabajo y disponibles dos médicos de hours. Todas las consultas son atendidas por llamada telefónica y / o revisión inmediata. Las disposiciones están disponibles para la admisión inmediata y directa a una sala de Enfermedades Infecciosas, si es necesario. </li></ol> 6. Nasal Wash (NW) Procedimiento <ol><li> Los lavados nasales (NW) se realizan a una visita de cribado inicial, así como de 48 hr, 7, y 14 días después de la inoculación. El método utilizado NW se toma de Naclerio et al. 8 Voluntarios naturalmente colonizados por S. pneumoniae se excluyen de la inoculación y seguimiento. </li><li> El voluntario se sienta cómodamente y la cabeza inclinada hacia atrás 30 ° respecto a la vertical. </li><li> Pida al voluntario que tomar una respiración profunda y aguantar la respiración mientras empuja la lengua hacia arriba y hacia atrás contra el techo de la boca. Mientras en esta posición, el voluntario se le pide a la señal de que están listos. </li><li> Una jeringa llena con 20 ml de solución salina se inserta en el espacio nasal anterior y 5 ml de solución salina es expulsado. El volunteer luego se inclina hacia adelante inmediatamente y expulsa el líquido exhalando rápidamente por la nariz en un recipiente de aluminio. </li><li> Repita este procedimiento 3 veces más para que cada fosa nasal ha sido lavadas dos veces y el completo de 20 ml se ha utilizado. </li><li> Piscina todas las muestras juntas en un tubo de centrífuga y se envía al laboratorio a temperatura ambiente para su procesamiento. </li></ol> 7. Nasal Wash Procesamiento <ol><li> Centrifugar las muestras durante 10 min a 3.345 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y almacena como alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf etiquetados a -80 ° C. </li><li> Añadir 100 l de medio LTGG 9 al sedimento y mezclar bien. Asegúrese de que el volumen total en el tubo en este punto se determina. Esta dilución se utiliza en el cálculo de la UFC de un carro positivo NW. </li><li> Placa de una caída de 20 l de la LTGG que contiene el sedimento resuspendido en una placa de agar sangre que contiene gentamicina y racha de toda la placa. <ol><li> Si el NO es posterior a la inoculación, Retirar 10 l de la LTGG que contiene el precipitado resuspendido y de uso para la cuantificación de bacterias por M &amp; M método. </li></ol></li><li> Añadir otra l 800 de LTGG al tubo NW y mezclar bien. </li><li> Placa de 25 l en una placa de agar sangre y 25 l en una placa de agar chocolate, rayando la placa entera. </li><li> Divida la bacteria cantidad restante en suspensión en medio LTGG en 2 crioviales y almacenar a -80 ° C. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C durante la noche en 5% de CO 2. </li><li> Examinar las placas al día siguiente por neumococo y otros patógenos respiratorios potenciales. </li><li> Los neumococos son identificados en las placas de morfología de las colonias. Alpha colonias hemolíticas con morfología ponente se subcultivan en agar sangre con un disco optoquina y se incubaron durante la noche. </li><li> Presuntos colonias neumocócicas que son sensibles optoquina se tiñen Gram para confirmar diplococos Gram positivos y serotipificación con el Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit. </li></ol>

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	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La plataforma EHPC tiene un número de usos potenciales, incluyendo su uso como un modelo de vacuna mucosa y como un sustituto de la protección para el ensayo de vacunas nuevas proteínas. El método depende de una técnica de inoculación consistente y una alta calidad NW. La reproducibilidad puede ser un problema con el inóculo. Debido a la naturaleza variable de las alícuotas congeladas bacterianas, puede ser difícil de replicar la dosis deseada. Una reducción a la mitad o duplicación de la dosis deseada se considera dentro del alcance. Es crucial que la cuantificación bacteriana hacerse inmediatamente antes y después de la inoculación, con el fin de determinar con precisión la cuantificación de las bacterias mediante recuento de CFU. Por esta razón, puede ser útil si las citas voluntarios ocurrir simultáneamente de modo que sólo un inóculo necesita ser preparado y el forro cuantificación hecho antes y después de la inoculación ocurre no más de 30 min aparte. El método NO requiere la cooperación del voluntario y no sería un método ideal en niños. Si el rendimiento es menor que 5 ml, el procedimiento se puede repetir utilizando hasta un extra de 20 ml. Dentadura postiza puede reducir el rendimiento NW. Si el voluntario tiene un bloqueo / nariz congestionada y la solución salina se acaba anterior después de la inserción, sonarse la nariz, inserte la jeringa un poco más atrás, e incline la cabeza hacia atrás más si es necesario. El NO es una técnica que mejora con la práctica. Algunos volumen por lo general se pierde de modo que el objetivo es lograr un rendimiento de al menos 10 ml. Si el voluntario puede degustar salina durante el NW entonces la conexión entre la nasofaringe y orofaringe posterior no ha sido adecuadamente cerraron por la lengua del voluntario. Si el voluntario se traga la mayoría de la solución salina, explicar el procedimiento de nuevo, haciendo hincapié en el empuje de la lengua contra el paladar de la boca. A continuación, repita el procedimiento para aumentar el volumen devuelto. Si el NW contiene una substantial cantidad de moco, lo mejor es quitarlo antes de la centrifugación. Vortex la muestra así como para aflojar cualquier cosa que pueda unirse a la mucosa y luego eliminar la mayor cantidad de las piezas grandes como sea posible mientras se quita como solución salina poco como sea posible. Un estudio previo EHPC en los EE.UU. se completó de manera segura y no tuvieron eventos adversos 11. Para garantizar la seguridad permanente de la plataforma EHPC, hemos puesto en marcha un protocolo de emergencia que se basa en el acceso las 24 horas al equipo de investigación. Los voluntarios reciben datos de contacto, permitiéndoles el acceso al equipo de investigación de 24 horas al día. Cualquier cuidado médico necesario se proporciona en el Royal Liverpool University Hospital. Como medida adicional de protección, un comité de seguridad formado por médicos y científicos de fuera del grupo de investigación recibe un informe de seguridad semanal. El informe contiene la dosis bacteriana cada voluntario recibió y si existen síntomas o enfermedades se informó. Este informe permite la seguridad de thestudio e para ser criticada externamente sin prejuicios. El comité de seguridad también están disponibles 24 horas al día en el improbable caso de una emergencia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0,9% de cloruro de sodio </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Leche descremada en polvo </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Caldo de soja tripticaseína </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Agar Columbia con sangre de caballo chocolated </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-latex kit </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

Transporte Experimental neumocócica humano (EHPC) es científicamente importante porque portador nasofaríngeo de Streptococcus pneumoniae es a la vez la principal fuente de transmisión y el requisito previo de la enfermedad invasiva. Un modelo de transporte permitirá la determinación precisa de las correlaciones inmunológicas de protección, el efecto inmunizante de transporte y el efecto de la presión de host en el patógeno en el nicho de la nasofaringe. Además, los métodos de detección de transporte útil en estudios epidemiológicos, incluyendo los estudios de vacunas, se pueden comparar. Objetivo Nuestro objetivo es desarrollar una plataforma EHPC que es un método reproducible segura y útil que se podría utilizar para selecciona a las vacunas neumocócicas nuevo candidato con la prevención de transporte como un sustituto de la inmunidad inducida por la vacuna. Se trabajará para pruebas de vacunas y la descripción de los mecanismos que subyacen EHPC y protección de la vacuna de Carriage 1. Las actuales vacunas conjugadas contra el neumococo proteger a los niños contra la enfermedad invasiva aunque las vacunas se necesitan urgentemente nuevas como la actual vacuna no confiere protección óptima contra la neumonía no bacteriémica y no ha habido evidencia de sustitución de serotipos por serotipos no vacunales 2-4. Método Nos inocular con S. pneumoniae en suspensión en 100 l de solución salina. La seguridad es un factor importante en el desarrollo del modelo de EHPC y se logra mediante el cribado voluntario intensivo y seguimiento. Un comité de seguridad formado por médicos y científicos que son independientes del estudio proporciona información objetiva sobre una base semanal. El inóculo bacteriano estandarizado y requiere que ningún producto animal se inoculan en los voluntarios (de origen vegetal medios de comunicación y de solución salina). Las dosis necesarias para la colonización (10 4 -10 5) son muy inferiores THAn las utilizadas en modelos animales (7 10) 5. Detección de carga neumocócica se ve reforzada por un alto volumen (lo ideal es&gt; 10 ml) de lavado nasal de moco que es relativamente libre. Este protocolo se ocupará de los aspectos más importantes del mismo a su vez. Estos son: (a) la selección de voluntarios, (b) la preparación del inóculo neumocócica, la inoculación (c), (d) el seguimiento y (e) la detección de carro. Resultados Nuestro protocolo actual ha sido seguro en más de 100 voluntarios en un rango de dosis utilizando dos diferentes serotipos bacterianos 6. Un estudio de rango de dosis con S. pneumoniae 6B y 23F se está realizando actualmente para determinar la dosis óptima para la inoculación de 50% de carro. Una tasa prevista del 50% del transporte permitirá que el modelo EHPC tener una alta sensibilidad para la eficacia de la vacuna con un número pequeño estudio.

Tenemos experiencia inoculando 159 personas, de las cuales 35 han llevado a neumococo. La dosis más baja que hemos logrado con el uso de transporte serotipo 6B era 11.100 UFC/100 l por fosa nasal, la dosis más alta era 313.000 UFC/100 l por fosa nasal. La dosis más baja que hemos logrado con el uso de transporte serotipo 23F fue 9.000 UFC/100 l por fosa nasal, la dosis más alta era 84.500 UFC/100 l por fosa nasal. Nuestro método de evaluación del transporte es un lavado nasal, elegido por un estudio reciente 10 demostró que el 91% de los voluntarios encontraron lavado nasal a ser más cómodo que hisopado nasofaríngeo, el lavado nasal fue también más probabilidades de detectar patógenos mediante cultivo microbiológico. Flora microbiana recuperados en placas de agar sangre inoculadas con NO puede ser variable y difícil de leer. La gentamicina se utiliza en la placa de agar sangre primero para seleccionar el neumococo. La placa de agar chocolate y la segunda placa de agar sangre se utilizan para detectar otro camino respiratorio potencialOgens que pueden ayudar o dificultar la colonización neumocócica. Un ejemplo de una placa de agar sangre inoculadas con NW que es fácil de leer se muestra en la Figura 1a; una placa difícil que contiene numerosos tipos de flora se muestra en la Figura 1b. En cada cita los voluntarios se les pidió que describa los síntomas del tracto respiratorio superior, si está presente, y las comparaciones entre los portadores y no portadores se destacó. De las 145 personas recientemente inoculados con neumococo, 28 se quejaron de los síntomas (Tabla 1). Ocho de ellos eran portadores, veinte no lo eran. Los síntomas más comunes fueron síntomas no específicos nasales (tabla 1). De los casos en que no se informaron síntomas sistémicos, como fiebre y / o malestar general, ninguna de las investigaciones llevadas a cabo mostraron evidencia de enfermedad neumocócica y los síntomas eran compatibles con la infección viral concurrente, salvo en un caso de amigdalitis. Dos neumocócica positivVoluntarios fueron tratados con antibióticos. Uno se quejaba de dolor de garganta y dolor de oído y, después de reunirse con el médico del estudio, se les recomienda tomar antibióticos como medida de precaución. El otro voluntario fue diagnosticado clínicamente con amigdalitis. Todos los voluntarios tuvieron una rápida resolución de los síntomas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Figura 1. Placa de agar sangre inoculadas con NW. Placas de agar sangre inoculadas con NO puede ser difícil de leer. 1a es un ejemplo de una placa que es fácil de leer claramente visible con neumococos. 1b es una placa con un montón de co-colonizadoras flora por lo que es más difíciles de detectar si está presente neumococos. <table border="1"><tbody><tr><td> Síntomas </td><td></td><td> Transporte (n = 32) </td><td> No Carriage (n = 112) </td></tr><tr><td> Todossíntomas </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> Sistémico </td><td> Fiebre </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> Malestar * </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Local </td><td> Orejas </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> Nariz </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> Garganta </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Caracterización de los voluntarios reportaron síntomas después de S. pneumoniae 6B inoculación. Todas las quejas fueron revisados ​​por el comité de seguridad externo y, a raíz de una investigación exhaustiva, sin síntomas se atribuyen a la enfermedad neumocócica. Los síntomas más comunes fueron dolor de garganta, congestión nasal y la enfermedad similar a la gripe.

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Transporte Experimental neumocócica humanos ofrece un modelo natural de carro y un modelo potencial para su uso en el desarrollo de vacunas. Esta técnica es valiosa aún complejo y conlleva un riesgo clínico mediante la introducción de un agente patógeno en un ser humano. Hemos desarrollado un protocolo detallado.

Carriage Experimental neumocócica Humanos

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K vistas.  Liverpool School of Tropical Medicine. Transporte Experimental neumocócica humanos ofrece un modelo natural de carro y un modelo potencial para su uso en el desarrollo de vacunas. Esta técnica es valiosa aún complejo y conlleva un riesgo clínico mediante la introducción de un agente patógeno en un ser humano. Hemos desarrollado un protocolo detallado.

Video: Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Ensayo experimental de metástasis

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Investigación

Medicina

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimiento para safena humana Venas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión y refuerzo externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Caracterización del tejido después de un nuevo método de desagregación para la piel micro-injertos Generación

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Ultrasonografía en las investigaciones de reproducción Experimental en ratas

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja