Los autores desean agradecer al Departamento de Biología de la Universidad de Syracuse y la Dra. Marilyn Kerr por su papel en la administración del curso de Vertebrados Biología comparativa. El laboratorio de Albertson es financiado por el subsidio R21DE019223 de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial, así como otorgar R01AG031922 de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Envejecimiento.

1. Transformación del plásmido de cDNA de destino Parte I: Transformación del plásmido (Tiempo requerido: 3 horas más de incubación durante la noche) <ol><li> Caliente el caldo SOC de nutrientes en un baño de agua 42 ° C (500 l por reacción) </li><li> Descongelar las células competentes en hielo </li><li> Añadir 1 l de plásmido a 25 células competentes l </li><li> Coloque sobre hielo durante 20 minutos </li><li> Las células de choque térmico de 42 ° C baño de agua durante 45 segundos </li><li> Coloque inmediatamente las células en hielo durante 2 minutos </li><li> Añadir 500 l de 42 ° C de caldo de nutrientes a cada vial de células </li><li> Agite a 37 ° C durante 2 horas a 255 revoluciones por minuto (rpm) </li><li> Placa 75 l de mezcla de transformación en placas de agar Luria Bertani (LB) </li><li> Incubar las placas invertidas a 37 ° C durante la noche </li></ol> Parte II: E. coli Cultura (Tiempo requerido: 15 minutos más una noche de incubación) <ol><li> Para cada reacción, alícuota de 3 ml de caldo LB y 3 l de 50 mg / ml de ampicilina en un tubo de cultivo </li><li> Raspar una colonia de bacterias de la placa de agar y añadir a cada tubo de cultivo </li><li> Agitar los tubos de cultivo a 37 ° C a 255 rpm durante la noche </li></ol> Parte III: Preparación plásmido (Tiempo requerido: 1,5 horas) <ol><li> Aislar el plásmido de cultivos de una noche con el primer Mini Kit de 5 FastPlasmid (Catálogo # 2300000) </li><li> Para comprobar la presencia de plásmidos preparados, ejecute el ADN eluido del kit en un gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) teñido con bromuro de etidio </li></ol> 2. In Situ marcada con DIG síntesis de ARN sonda Parte I: Linealización del plásmido (Tiempo requerido: 2.5 horas) <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: <table border="1"><tbody><tr><td> Preparado plásmido </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> * Restricción de enzimas </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Buffer ** </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10 veces más albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) de agua </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Se incuba a 37 ° C durante 2 horas * Varía con el plásmido ** Varía con la enzima de restricción </li></ol> Parte II: Transcripción (Tiempo requerido: 3 horas) <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineal plásmido </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Buffer 10X ** Transcripción </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Digoxigenina Mix Etiqueta </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Polimerasa </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Inhibidor de la RNasa </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> DEPC agua </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Se incuba a 37 ° C durante 1 hora </li><li> Añadir 2 l * de la polimerasa </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 1 hora </li><li> Añadir 2 l de DNasa </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 20 minutos * Varía con el plásmido ** Varía con la polimerasa </li></ol> Parte III: Precipitación (Tiempo requerido: 5 minutos más 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender) <ol><li> Agregar 4 l de 0,2 M EDTA </li><li> Añadir 5 l de cloruro de litio 4M </li><li> Añadir 150 ml de hielo frío etanol al 100% </li><li> Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia </li><li> Seco en pelets durante 7 minutos </li><li> Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 5 minutos </li></ol> Parte IV: Fraccionamiento - Realizar sólo si el tamaño de la sonda es mayor de 0,6 kb (Tiempo requerido: Varía según el tamaño de la sonda, por lo general no más de 20 minutos) <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se combinan: <table border="1"><tbody><tr><td> Sonda de ARN </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC agua </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Carbonato de Sodio </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar en un baño de agua a 60 º C. La base del tiempo de incubación en la ecuación: Tiempo (min) = (a partir kb - deseado kb) / (0.11 x kb x partida deseado kb) Tamaño medio deseado = 0,6 kb </li></ol> Parte V: La precipitación final (Tiempo requerido: 5 minnutos más de 2 horas de incubación durante la noche, una hora para centrifugar y resuspender, 1 hora por electroforesis en gel) <ol><li> Añadir 40 l de agua DEPC </li><li> Añadir 8 Acetato de Sodio l </li><li> Añadir 1,04 l de ácido acético glacial </li><li> Añadir 240 l de hielo frío etanol al 100% </li><li> Se incuba a 80 ° C durante 2 horas a la noche a la mañana </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, se decanta el sobrenadante de distancia </li><li> Seco en pelets durante 7 minutos </li><li> Vuelva a suspender en 20 l de agua DEPC </li><li> Vortex para mezclar </li><li> Para comprobar la presencia de riboprobe, ejecutar la solución re-suspendido en un gel teñido 1% TAE con bromuro de etidio </li></ol> 3. Todo el montaje hibridación in situ Parte I: La fijación de embriones y la digestión de proteinasa K (Tiempo requerido: Fijar horas de la noche, más 4 al día siguiente para el almacenamiento, 2,5 horas de almacenamiento a la Parte II) <ol><li> Recoger etapas embriones de pez cebra y fijar en 4% paraformaldehido (PFA) durante la noche a 4 ° C </li><li> Lavado de embriones fija en tampón fosfato salino que contiene 0,1% de Tween-20 (PBST) tres veces durante 10 minutos cada uno </li><li> Para garantizar que la exposición de los embriones a los reactivos experimentales, los embriones de forma manual dechorionate (si es necesario) con unas pinzas de punta fina </li><li> Deshidratar embriones por lavado en una serie gradual de 25% y 50% de metanol en PBST durante una hora cada lavado, a continuación, almacenar en el 100% de metanol a -20 ° C </li><li> Cuando esté listo para usar, rehidratar embriones en PBST por el lavado en un 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST durante 10 minutos cada uno. Finalmente lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en el 100% PBST. Fecha exacta no es importante para los lavados con PBST / metanol </li><li> Embriones cloro en una solución de peróxido de hidrógeno al 10% en PBST, si es necesario, para eliminar los pigmentos oscuros. Embriones se incuban en una solución de peróxido de hidrógeno durante 10-20 minutos, dependiendo de la edad del embrión, y la tapa del tubo de microcentrífuga deben permanecer abiertas para evitar la acumulación de presión de aire </li><li> Embriones digerir con 50 mg / ml de proteinasa K diluido 1:5000 en PBST durante 3-15 minutos, dependiendo de la edad del embrión </li><li> Fijar de nuevo los embriones en el 4% PFA durante 30 minutos y luego lavar 3 veces en PBST durante 5 minutos cada uno </li></ol> Parte II: La hibridación de ribosondas (Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para la hibridación, 1,5 horas del día siguiente a la Parte III) <ol start="9"><li> Prehybridize embriones con solución de prehibridación (PHS) en un horno precalentado a 70 ° C baño de agua durante 2-3 horas </li><li> Quitar PHS, se añaden 0,5 ml solución de hibridación y 1,5 l previamente sintetizadas riboprobes digoxigenina etiquetados, se incuba a 70 ° C durante la noche. La temperatura puede variar dentro de unos pocos grados en función del objetivo riboprobe </li><li> Al día siguiente, lave los embriones a 70 ° C en soluciones graduales de 75%, 50% y el 25% de PHS de citrato de sodio 2 veces con solución salina (SSC) de 10 minutos cada uno, luego se lava en 0,2 X SSC durante 30 minutos a 68 ° C </li><li> Lave en tampón de ácido maleico (MAB) 2 veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente </li></ol> Parte III: anti-digoxigenina (α-DIG) incubación del anticuerpo (Tiempo requerido: 3 horas y durante la noche para bloquear, 2,5 horas del día siguiente a la Parte IV) <ol start="13"><li> La transferencia de embriones en una placa de 12 pocillos </li><li> Bloque de pre-embriones en una solución de 2.1 ml de bloqueo por lo menos 3 horas a temperatura ambiente </li><li> Al mismo tiempo, antes de bloquear los anticuerpos mediante la preparación de un segundo volumen de la solución de bloqueo y la dilución 1:2000 del anticuerpo anti-digoxigenina en esta solución </li><li> Eliminar pre-y agrega 1-2 ml pre-bloqueado α-DIG solución, incubar durante la noche a 4 ° C </li><li> Al día siguiente, lave los embriones en el MAB. Permitir que los embriones se incuban en el MAB durante 5 minutos, luego realizar los cambios de tampón y se incuba durante dos de 10 minutos, un minuto 30 y un intervalo de 60 minutos. Fecha exacta no es necesario </li><li> Lavado de embriones 3 veces durante 5 minutos en cada una de fosfatasa alcalina (AP) tampón </li></ol> Parte IV: La tinción y el procesamiento final (Tiempo requerido: 1 hora o toda la noche para la tinción, dependiendo de la riboprobe utilizados, 4 horas a partir de lavados de glicerol, 06.10 horas por lavado de glicerol, puede ser almacenado en glicerol) <ol start="19"><li> Agregar 1.2 ml de solución colorante a los embriones, envolver en papel de la placa y comprobar manchas a intervalos regulares (cada 20 minutos) hasta que la tinción es suficiente </li><li> Lavado de embriones con PBST dos veces durante 5 minutos cada uno para detener la reacción de tinción </li><li> Deshidratar embriones con 10 minutos se lava en el 25% (1 vez) y el 50% (2 veces) de metanol en PBST, luego en el 100% de metanol, para eliminar manchas de fondo </li><li> Permita que los embriones se incuban en metanol al 100% por lo menos 2 horas a temperatura ambiente </li><li> Rehidratar en PBST con 10 minutos se lava en el 50% (2 veces) y el 25% (1 vez) de metanol en PBST, luego lave en el 100% PBST 2 veces </li><li> Transferencia e manchadombryos a una solución de glicerol al 80% en PBST, utilizando una serie gradual de lava, y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> Recetas: <ul><li> Placas de agar LB-10 g de agar LB + 250 ml de agua destilada, autoclave, cuando están frías al tacto añadir 250 l de ampicilina, vierta solución caliente 15-20 ml en cada placa de Petri, permiten agar para solidificar </li><li> Caldo de LB-12.5 g de caldo de LB + 200 ml de agua destilada, autoclave, deje que se enfríe antes de su uso </li><li> 1% TAE gel de agarosa 0,4 g, 40 ml de 1X TAE, 2 l de bromuro de etidio; carga de 7 l plásmido (plásmido de transformación de la meta de ADNc) o 3 y 4 riboprobe l l de agua DEPC (In situ Síntesis marcada con DIG sonda de ARN) + un colorante de carga l, 5 l escalera del ADN </li><li> Prehibridación solución-formamida al 50%, 5X SSC, 9,2 mm ácido cítrico, el 1% de Tween-20 </li><li> Hibridación solución de prehibridación solución más 500 mg / ml tRNA y 50 ug / ml de heparina </li><li> MAB-100mm ácido maleico, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, el pH a 7.5 </li><li> Solución de bloqueo-3 partes del MAB, una parte del 10% reactivo Boehringer bloqueo en el MAB, un calor parte desactivado cordero suero </li><li> AP-buffer 60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Solución-5-Bromo-4-cloro-3-indolil tinción fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) en tampón AP </li></ul> 4. Los resultados representativos Cuando se realiza correctamente, la reacción entre el NBT, BCIP y fosfatasa alcalina se forma un precipitado violeta que deben aparecer en el embrión del pez cebra como una mancha púrpura. Riboprobes debe ser previamente sintetizada a partir de cDNA correspondiente al gen de interés. Por lo tanto, se puede concluir cualquier mancha visualizada representa las áreas del pez cebra en el que ha sido el gen de interés transcribir en esta etapa de desarrollo en particular. A los efectos de este curso, riboprobes se sintetizaron a partir aldh1a2 (antes RALDH2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates y otros, 2005.) MyoD1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) y myl7 (antes cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. La tinción se espera en la línea media y en las estructuras anatómicas como las somitas, tailbud, miotoma, el cerebro y el corazón. Mutantes Ace/fgf8a se espera que tengan defectos de muchas de estas estructuras. La tinción se visualiza fácilmente usando un microscopio de disección estándar. Fuentes adicionales contienen más información y resolución de problemas en el deseo de técnicas similares a las descritas aquí (Clark, 2003;. D&#39;Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un embrión de pez cebra 24 horas después de la fecundación, que se ha hibridado con riboprobes específicas para aldh1a2. Tinción específica se puede ver en los ojos, la parte posterior del cerebro, aleta pectoral brote primordios, y somitas. Anterior es la parte superior, posterior está en el fondo. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un embrión de pez cebra en la etapa 13 somite de desarrollo que se ha hibridado con una sonda específica para fgf8a. Tinción específica se ve en el telencéfalo, diencéfalo dorsal, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, somitas, y tailbud. Ventral está a la izquierda, dorsal está a la derecha. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A 22 horas después de la fecundación de embriones de pez cebra que se ha hibridado con una específica para riboprobe pax2a, un marcador robusto útil para visualizar el sistema nervioso. Tinción específica se puede ver en la cisura coroidea, la cobertura del cerebro medio-hindbrain, vesícula ótica, y las neuronas de médula espinal. Vista dorsal con el anterior a la izquierda.

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	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain.">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li><li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. 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Deseo fue utilizado en un curso de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativa para ayudar a los estudiantes a entender el papel de la genética en el desarrollo anatómico a través de la visualización de patrones de expresión génica conocida. Para la primera parte del curso, los estudiantes realizaron disecciones en los organismos que representan a varios taxones cordados diferentes, lo que les permite suficiente tiempo para estudiar, comprender, comparar, y la anatomía de vertebrados contraste. Como introducción a la segunda parte del curso, los estudiantes se les dio una conferencia formal que describe el desarrollo del pez cebra y la anatomía. Los métodos y los resultados previstos del experimento DESEA también fueron discutidos. Los estudiantes se les dio el pez cebra vive en somitogenesis y prim-6 etapas de desarrollo, ya las 2 y 5 días después de la fertilización (dpf) para examinarla bajo el microscopio de disección. Esto fue a dar a los estudiantes una mejor comprensión de lo que parece embriones de pez cebra y los tipos de cambios morfológicos que ocurren durante la ontogenia. En la sesión de laboratorio siguiente, los estudiantes recibieron embriones de pez cebra en el que deseo se había realizado previamente. Se les pidió que estudiar y describir los patrones de expresión genética para cada gen de interés (riboprobe utilizado). Embriones utilizados para WISH se derivan de las uniones entre miembros de una línea de ace/fgf8a heterocigotos. Sobre la base de la herencia mendeliana, el 25% de los embriones de los apareamientos ace/fgf8a se espera que sea homocigotos mutantes y exhibir los defectos de muchas de las estructuras anatómicas se centró en este curso. Basándose en los informes publicados y observaciones no publicadas en el laboratorio de Albertson, defectos en el cerebro y el corazón de bucle incorrecto se esperaba, así como defectos en las somitas (Brand et al, 1996;. Albertson y Yelick, 2005; observaciones personales). Los estudiantes se les pidió que examinar todas las muestras, de tipo salvaje (animales heterocigotos se distinguen de sus hermanos de tipo salvaje en las primeras etapas de desarrollo) y homocigotos mutantes, para cada patrón de expresión génica presentados. Luego se les pidió a escribir informes de laboratorio que describe sus resultados, y en base a sus conocimientos de anatomía y genética, ¿cómo la expresión del gen defectuoso puede haber precipitado malformaciones anatómicas. Los estudiantes parecían recibir este ejercicio de laboratorio con el entusiasmo y la curiosidad. La mayoría nunca habían utilizado deseo antes y estaban muy interesados ​​en esta parte del curso. Estudiantes que se encuentren los diferentes patrones de expresión genética en los embriones de pez cebra intrigante, algunos incluso se describen los patrones de tinción visualizarse mediante la asociación con conocidos diseños y símbolos, como una cara sonriente. Los informes de laboratorio resultantes mostraron que los estudiantes tenían un conocimiento general del protocolo de deseo y la expresión de genes en estructuras anatómicas específicas. Los estudiantes también fueron requeridos para entender las funciones específicas de los genes estudiados utilizando desee durante el tiempo de laboratorio (Stickney y otros, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Gita-Loganathan et al, 2008a;.. Gita-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente sin embargo, que algunos estudiantes tenían un conocimiento limitado de fondo de las vías de señalización y los genes de interés. Más información acerca de estos conceptos en el deseo de charla introductoria puede ser una adición bienvenida a la utilización de deseo en el futuro cursos de Biología Comparada de Vertebrados. Dado que el protocolo generalmente toma cuatro días consecutivos, dependiendo del horario del curso, los alumnos sólo pueden ser capaces de completar una parte del experimento en la clase y el profesor debe ser responsable por el resto. En nuestra clase de Biología de Vertebrados comparativo, los alumnos de las reacciones de tinción en el laboratorio, mientras que el Asistente de Enseñanza realizado todos los pasos anteriores. Si se prefiere que los estudiantes realizan WISH en clase, el protocolo puede ser dividida en sub-unidades que se pueden realizar en varias sesiones de laboratorio, en función del tiempo de la clase. Si no es factible para los estudiantes para llevar a cabo todo el protocolo, ya que fue aquí, debido a la reunión de laboratorio una vez por semana, los estudiantes pueden agregar la solución de tinción en el comienzo de la clase y, en función de la riboprobe utilizados, tienen la coloración completa dentro de una hora. El tiempo necesario para que la mancha de desarrollar varía mucho con cada riboprobe y una variedad de condiciones experimentales, y debe ser determinado antes de la clase. Cabe destacar que, si los alumnos sólo será el desarrollo de la mancha en el laboratorio, los instructores serán responsables de todos los pasos anteriores, lo que requerirá mucho tiempo y esfuerzo fuera de las aulas. Si lo desea, una alternativa más corta que deseen podrían ser inmunohistoquímica, con las etiquetas de anticuerpos para visualizar la localización de proteínas, sin embargo en este momento, el pez cebra anticuerpos específicos para los genes de desarrollo no están disponibles. Otra opción sería realizar deseo en diferentes especies de vertebrados unº que los estudiantes comparar los patrones de expresión de los mismos genes en diferentes organismos (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. emergentes organismos modelo, de 2008; emergentes organismos modelo, 2010). El objetivo general del uso de deseo en un curso de Biología de Vertebrados comparativo era demostrar a los estudiantes como técnicas de biología molecular se utilizan para estudiar el desarrollo anatómico. Es también una oportunidad para que los estudiantes especular acerca de cómo modificar la expresión de genes puede conducir no sólo a malformaciones en el desarrollo, sino también para el cambio evolutivo. Formalizada como la biología evolutiva del desarrollo (a menudo denominado como &quot;evo-devo&quot;), este campo de rápido crecimiento de estudio tiene como objetivo vincular el genotipo y el fenotipo a través del desarrollo, y para dilucidar las bases potenciales mecánica del cambio evolutivo. Con el auge de este campo, más ecólogos, biólogos de organismos, y los fisiólogos están empleando técnicas moleculares en sus investigaciones. Nosotros sostenemos que el uso del deseo en un curso de Vertebrados Biología comparativa le ayudará a mantener el plan de estudios al día con los avances tecnológicos actuales y conceptuales en la investigación, y para facilitar un mejor alineamiento horizontal de los cursos de nivel superior mediante la combinación de la biología subcampos biológica. Por otra parte, este enfoque integrador proporcionará a los estudiantes la oportunidad de aprender una variedad de técnicas de investigación biológica en un curso, lo que lleva a una educación más diversificada y la promoción de la futura investigación científica interdisciplinaria.

<ul><li> Autoclave </li><li> Microcentrífuga </li><li> 37 ° C incubadora (con agitador) </li><li> 4 ° C de microcentrífuga </li><li> Baño de agua </li><li> Vórtice </li><li> Aparato de electroforesis en gel </li><li> Congelador a -20 ° C </li><li> -80 ° C congelador </li><li> Rocker / agitador </li><li> 4 ° C refrigerador </li><li> Microscopio de disección (de preferencia con una pantalla de la enseñanza o la cámara) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

Todo el montaje hibridación in situ (WISH) es una técnica común en los laboratorios de biología molecular para estudiar la expresión génica mediante la localización de las transcripciones de ARNm específicos dentro de toda muestra de montaje. Esta técnica (adaptado de Albertson y Yelick, 2005) fue utilizado en un nivel superior de pregrado en el aula de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativa en la Universidad de Syracuse. Los dos primeros tercios del curso de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativo dio a los estudiantes la oportunidad de estudiar la embriología y anatomía de los organismos que representan a varios taxones diferentes cordados principalmente a través de disecciones tradicionales y el uso de modelos. La parte final del curso participan un enfoque innovador para la enseñanza de la anatomía a través de la observación del desarrollo de los vertebrados que emplean técnicas moleculares en la que desean se llevó a cabo en embriones de pez cebra. Un crecimiento de fibroblastos heterocigotos factor 8 un (fgf8a) mutante línea, as, se utilizó. Debido a la herencia mendeliana, as intercrosses tipo producido salvajes, heterocigotos y homocigotos mutantes ace/fgf8a en una proporción de 1:2:1. Sondas de ARN con patrones de expresión se conoce en la línea media y en el desarrollo de las estructuras anatómicas, como el corazón, somitas, tailbud, miotoma, y ​​el cerebro se utilizaron. WISH se realizó con el pez cebra en el 13 y somite etapas prim-6, con los estudiantes de realizar la reacción de tinción en la clase. El estudio de los embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo dio a los estudiantes la capacidad de observar cómo estas estructuras anatómicas cambiado en la ontogenia. Además, algunos mutantes ace/fgf8a muestra bucle corazón inadecuado, y defectos en los somitas y el desarrollo del cerebro. Los estudiantes en esta práctica observada el normal desarrollo de diversos sistemas de órganos con la anatomía externa, así como patrones de expresión génica. También se identifican y describen los embriones mostrando un desarrollo inadecuado anatómica y la expresión de genes (es decir, mutantes putativos). Para los instructores de las instituciones que aún no poseen el equipo necesario o cuando los fondos para el laboratorio y la innovación curricular son limitados, el costo financiero de los reactivos y los aparatos puede ser un factor a considerar, así como el tiempo y el esfuerzo necesario por parte de la instructor independientemente de la configuración. Sin embargo, sostenemos que el uso de deseo en este tipo de salón de clases de laboratorio puede proporcionar un vínculo importante entre la genética del desarrollo y la anatomía. A medida que avanza la tecnología y la capacidad para estudiar el desarrollo de organismos en el nivel molecular se hace más fácil, más barato y cada vez más popular, muchos biólogos evolucionistas, los ecologistas, y los fisiólogos están recurriendo a estrategias de investigación en el campo de la biología molecular. WISH utilizando en una clase de laboratorio de Biología de Vertebrados comparativo es un ejemplo de cómo las moléculas y la anatomía pueden converger en un solo curso. Esto le da a los estudiantes universitarios de nivel superior la oportunidad de practicar las técnicas modernas de investigación biológica, lo que lleva a una educación más diversificada y la promoción de la futura investigación científica interdisciplinaria.

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Todo el montaje<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (WISH) fue utilizado en un nivel superior de grado comparativo curso de Biología de Vertebrados, además de vertebrados disecciones. Esto dio a los estudiantes la oportunidad de estudiar los patrones de expresión génica, así como anatomía, que une el estudio de la biología molecular y organismal dentro de un curso.

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

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Research

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Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K vistas.  Syracuse University. Todo el montaje In situ (WISH) fue utilizado en un nivel superior de grado comparativo curso de Biología de Vertebrados, además de vertebrados disecciones. Esto dio a los estudiantes la oportunidad de estudiar los patrones de expresión génica, así como anatomía, que une el estudio de la biología molecular y organismal dentro de un curso.

Video: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...