Los autores desean agradecer a Laurence Cooper, Singh Harjeet y Hurton Lenka por su trabajo en la creación de la primera K562 AAPC y mIL21 vectores de fusión. La financiación de este trabajo fue proporcionado por el Programa de UT MD Anderson Physician científico, la Fundación San Baldrick, y las leyendas de Friendswood.

1. Aislamiento de PBMC de Buffy Coat Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se obtienen por centrifugación densidad de flotación en Ficoll-Paque de las muestras de donantes sanos capa leucocitaria obtenidas por aféresis. <ol><li> La centrifugación de Ficoll-Paque se hace como por el protocolo del fabricante con ligeras modificaciones. </li><li> Añadir PBS a un donante normal de bancos de sangre la capa leucocitaria a un volumen final de 140 ml (volumen típico de la capa leucocitaria es 40-70 mL). </li><li> Capa de 35 ml de muestra de la capa leucocitaria en 15 ml de Ficoll-Paque (4 tubos). </li><li> Centrifugar a 400 g durante 20 minutos sin freno. </li><li> Recuperar los PBMCs de la Ficoll-Paque: interfaz de plasma, no descartan los glóbulos rojos en la parte inferior de la Ficoll-Paque. </li><li> Lave PBMCs tres veces con PBS, centrifugando cada vez a 400 g durante 10 minutos. </li><li> PBMCs se puede utilizar directamente para la expansión de las células NK en esta etapa o células NK pueden ser aislados por RosetteSep (Sección 4) </li><li> PBMCs restantes pueden ser congelados en FBS que contiene DMSO al 10% en nitrógeno líquido. </li><li> Aspirar el Ficoll y recoger los glóbulos rojos a partir del paso 5 en dos tubo de centrífuga de 50 ml, lavar tres veces con PBS (añadido a la marca de 50 ml), cada vez que aspire el sobrenadante rozando la parte superior de la capa de glóbulos rojos para eliminar los granulocitos. </li><li> Los glóbulos rojos pueden ser utilizados inmediatamente para RosetteSep  purificación de las células NK (véase la Sección 4) o almacenado en un volumen igual de solución de Alsever a 4 ° C para su uso posterior (Los glóbulos rojos se puede almacenar por un máximo de 4 semanas). </li></ol> 2. La expansión de células NK La expansión de las células NK puede iniciarse mediante PBMC o células NK purificadas. La cantidad de PBMCs utilizados para la expansión puede variar según la cantidad de las células NK deseado al final de una expansión de tres semanas, consulte al representante de la sección de resultados para más detalles. (Ver Nota 1) ESTIMULACIÓN 1 Día 0 <ol><li> Para cada 5x10 6 PBMCs ser ampliado, cuenta e irradiar 10x10 6 K562 CL9 mIL21 con un irradiador gamma a 100 Gy. </li><li> Después de la irradiación, se lavan las células con PBS y resuspender las células NK en la expansión de medios (Nkem). </li><li> Semillas de 5x10 6 PBMC irradiadas con 10x10 6 K562 CL9 mIL21 (1:2) en 40 ml de Nkem en un matraz T75 y colóquelo en una incubadora a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li></ol> Días 3 y 5 <ol start="4"><li> Recuperar las células por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y vuelva a colocar la mitad de los medios de comunicación con Nkem fresca (la adición de IL-2 frescas para el volumen de los medios de comunicación todo) y al cultivo. </li></ol> ESTIMULACIÓN 2 Día 7 <ol><li> Cuente el número de células en cultivo al final de una semana. </li><li> Ponga a un lado 5x10 5 células de fenotipo por citometría de flujo (ver Nota 2) </li><li> Para cada uno de 5x10 6 células se estimularon de nuevo, contar e irradiar 5x10 6 K562 CL9 mIL21 con un irradiador gamma a 100 Gy. </li><li> Añadir un número igual de elementos combustibles irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1 ratio) y resuspender en Nkem a 2.5x10 5 el total de células / ml (Ver Nota 3). </li><li> Las células de las semillas en frascos T75 (un máximo de 50 ml por frasco). </li></ol> Días 10 y 12 <ol start="6"><li> Cuente el número de células. </li><li> Cambiar los medios de comunicación con toda Nkem fresco basado en el número de células (Ver Nota 3). </li></ol> El día 14 <ol start="8"><li> Al final de dos semanas de la expansión de contar el número de células en cultivo. </li><li> Ponga a un lado 5x10 5 células de fenotipo por citometría de flujo (ver Nota 2) </li><li> Si la expansión se inició a partir de PBMC las células NK pueden ser purificados en esta etapa de expansión mediante el protocolo de purificación RosetteSep (véase la Sección IV). Si la expansión se inició a partir de las células NK purificadas proceder a la estimulación 3. </li><li> Después de la purificación de lado 5x10 5 células de fenotipo por citometría de flujo para verificar la pureza de las células NK (como en el paso 8). </li><li> Continuar con la estimulación 3 con todas las células NK purificadas (Ver Nota 4). </li></ol> ESTIMULACIÓN 3 <ol><li> Resuspender las células NK con irradiado K562 CL9 mIL21 (1:1) en Nkem basado en el número de células (Ver Nota 3). </li></ol> Días 17 y 19 <ol start="2"><li> Cuente el número de células. </li><li> Cambiar los medios de comunicación con Nkem fresco basado en el número de células (Ver Nota 3). </li></ol> El día 21 <ol start="4"><li> Al cabo de tres semanas de la expansión de contar el número de células en cultivo. </li><li> Recuperar 1x10 6 células para el análisis de citometría de flujo para el panel completo de las células NK anticuerpos fenotipo (ver Tabla 1). </li><li> Congelar las células de FBS que contiene 10% de DMSO a una densidad máxima de 5x10 7 células por frasco para su uso futuro. </li></ol> 3. Células NK Citotoxicidad de ensayo <ol><li> Descongelar un vial de células NK y la semilla en Nkem, un día antes de performing ensayo de citotoxicidad para permitir la recuperación. </li><li> Para cada ensayo de células de la citotoxicidad NK utilizando una línea de células objetivo único, 6x10 5 células NK y 3x10 5 células diana se requieren (ver nota 5). </li><li> Prepare CAM-Media mediante la dilución de calceína-AM (stock 1 mg / ml en DMSO) en Nkem (Ver Nota 6). </li><li> Resuspender 10 6 células diana en 1 ml de CAM-media (Ver Nota 7). </li><li> Incubar durante 1 hora a 37 ° C, con agitación ocasional. </li><li> Resuspender las células NK en 1x10 6 células / ml y añadir 200uL de la suspensión de las células NK a cada uno de los tres pozos de fondo en U de 96 pocillos correspondientes a 10: 1 E: índice T se muestra en la Figura 1. (Ver Nota 8) </li><li> Añadir 100uL de los medios de comunicación completa a todos los pocillos restantes a excepción de &quot;Máximo&quot;. </li><li> Añadir 100uL del 2% Triton X-100 a &quot;Máximo&quot;. </li><li> Realizar diluciones seriadas de las células NK para la E 5 siguientes: Relaciones de T mediante la transferencia de 100uL de células cada vez, mezclar bien. Deseche 100uL de los últimos pozos (E: T proporción de 0.3125:1). </li><li> Después de 1 hora de carga calceína, lavar las células diana en Nkem dos veces, la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9) </li><li> Recuento de las células diana y resuspender en 1x10 5 células / ml. </li><li> Añadir 100 ml de las células diana a cada pocillo (1x10 4 / y). Centrifugar durante 1 minuto a 100 g para iniciar el contacto de la célula. </li><li> Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 4 horas. </li><li> Mezclar suavemente la cultura con la pipeta con una pipeta de 100 l con el fin de suspender de manera uniforme la calceína liberados, la desaceleración de placas a 100 g durante 5 minutos para que sedimenten las células y la transferencia de 100 L del sobrenadante a un nuevo plato con cuidado para evitar burbujas. Pop todas las burbujas que se forman con aguja fina. </li><li> Lea la placa con un lector de placas fluorescentes (excitación filtro de 485 nm, emisión de filtro de 530 nm). Lectura inferior es recomendable. </li><li> Calcular porcentaje de lisis específica de acuerdo a la fórmula [(versión de prueba de liberación espontánea) / (máximo liberación - la liberación espontánea)] x 100. </li></ol> 4. NK purificación de células por RosetteSep <ol><li> Tener 100 veces el exceso de glóbulos rojos a la de PBMC o células expandidas, en un tubo de 50 ml (100:1 RBC: CMSP). </li><li> Si utiliza los glóbulos rojos frescos vaya directamente al paso siguiente o si los glóbulos rojos se almacenan en la solución de Alsever s, contar el número de glóbulos rojos y lavar apropiado (100 veces superior a) la cantidad de glóbulos rojos con PBS suplementado con FBS al 2% tres veces, centrifugando a 1200 rpm durante 10 minutos cada vez. </li><li> Los glóbulos rojos se combinan con PBMC a partir del paso 1.7 o células expandidas desde el paso en PBS 2,10 + 2% de SFB a un volumen final de 1 ml por 5x10 7 de PBMC o células expandidas. </li><li> Añadir 1μL de RosetteSep  Células NK Cóctel de enriquecimiento por 1x10 6 de PBMC o células expandidas. </li><li> Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos con agitación suave cada 5 minutos. </li><li> Añadir un volumen igual de PBS + 2% de SFB mezclar suavemente y la capa en la parte superior de Ficoll-Paque. </li><li> Repita los pasos de centrifugación Ficoll-Paque descrito para el aislamiento de PBMC (Sección I). </li><li> Contar las células NK se recuperó después de la purificación y dejar de lado 5x105 células de phenotpying por citometría de flujo para la pureza de las células NK (Paso 8). </li></ol> 5. Notas NOTA 1. Las células NK se puede ampliar directamente de PBMCs, o de RosetteSep células NK purificadas . Hemos tomado nota de la eficiencia de expansión similar, pero algunos donantes pueden tener un número muy bajo de células NK que resulta en la purificación de dificultad RosetteSep antes de la expansión. NOTA 2. Habitualmente usamos CD56-FITC, CD16-PE y CD3-PE-Cy5 para fenotipificación durante la expansión, la enumeración de las células NK como los que son CD3 negativo y CD16-CD56 o positiva. NOTA 3. En cada cambio de los medios de comunicación o la estimulación, las células se resuspenden en 2,5 x 10 5 / ml para mantener PBMC / NK número de células en o menos de 2 millones por ml en etapas pico de la expansión. Esto evitará el agotamiento de los nutrientes y ayudan a lograr la expansión máxima y la supervivencia. NOTA 4. La tasa de expansión es NK dependientes de los donantes y al final de estímulos 1 y 2 parte de las células se pueden congelar y parte amplió aún más en función de la necesidad de experimentación. Hemos tenido buen éxito en el uso de las células congeladas para la expansión en un momento posterior. NOTA 5. Con el fin de dejar espacio para el error se recomienda utilizar un mínimo de 7x10 5 células NK se resuspendieron en 700 ULS de Nkem y 4x10 5 calceína-AM células blanco manchado resuspendieron en 4 ml de Nkem para establecer el ensayo de citotoxicidad. Si se utiliza una pipeta multicanal para la siembra de las células diana mayor volumen de las células (hasta 6x10 5 en 6 mL) puede ser necesaria en función del tamaño de la cuenca media que se utiliza. También el número recomendado de las células NK son específicamente para el E: T ratios muestran en el protocolo, para el uso de mayor E: T ratios aumentoel número de células NK por ml en consecuencia (por ejemplo, para una E 40:1: índice T 4x10 utilizar 6 células / ml) NOTA 6. Se recomienda realizar un preliminar calceína-AM de carga de la valoración de la línea celular de destino de su elección, con las siguientes diluciones de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 y 1:100 para lograr la diferencia óptima entre la liberación máxima y espontánea. NOTA 7. Cuando se utiliza una línea de células adherentes como objetivo, en primer lugar preparar la suspensión de células individuales usando no enzimática celular tampón de disociación. Si se realiza la ADCC, prepare un tubo de duplicados de las células diana en el CAM-medios de comunicación. NOTA 8 Si se realiza la ADCC, añadir mismas células NK a tres pozos correspondientes a 10:1 E:. T para la ADCC. Repita este procedimiento para otros donantes. Repita el procedimiento para las células diana adicionales. NOTA 9. Si se realiza un experimento ADCC, después de 45 minutos de carga calceína, añadir 10ug de anticuerpos específicos para inducir ADCC contra las células diana. Después de 15 minutos, lavar las células diana en medio completo dos veces, la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm. Resuspender las células en el 1x10 5 células / ml y proceder con el siguiente paso en el protocolo. 6. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cuando la expansión se realiza según el esquema descrito anteriormente, utilizando 5x106 PBMC como material de partida, típica de las células NK gama rendimientos de 1x10 9 al 10 10 células (variabilidad dependientes de los donantes). La figura muestra la expansión de células NK veces (n = 19) en comparación con las células NK presentes en el producto original (media + / - cuartil). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La ampliación de las células NK expresan diferentes receptores de células NK que son comparables a los dilatar las células NK primaria, con algunas excepciones (CD11b, CD160 y CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. PBMCs recuperación de la capa leucocitaria es dependiente de los donantes y puede variar de 6 a 300x10 800x10 6. Las células NK pueden comprender un 2% - 18% de las PBMC. Para la purificación de las células RosetteSep ampliado, la recuperación de las células NK pura en el día 14 oscila entre 40-70%. Siguiendo el protocolo recomendado de la expansión y la purificación, la pureza de las células NK de 99% se puede esperar. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Ampliado las células NK han demostrado citotoxicidad frente a una serie de líneas de células tumorales, incluyendo neuroblastoma, AML, el osteosarcoma y el melanoma (representante de la matanza LMA muestra como la lisis por ciento específicas).

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	<li>McKenna, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy:+a+six-year+single-institution+experience.">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li><li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children.">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li><li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications.">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li><li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering.">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li><li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56++natural+killer+cells.">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li><li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells.">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li><li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets:+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation.">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li><li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells.">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy.">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells.">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li><li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A,+4-1BB+ligand,+and+interleukin-15.">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li></ol>

La expansión de células NK y los medios de activación (Nkem) <ul><li> 90% de RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% de suero fetal bovino (Gibco) </li><li> 1x penicilina / estreptomicina (Cellgro) </li><li> 1x L-glutamina (Gibco) <ul><li> Filtro esterilizar los medios de comunicación antes de su uso. </li></ul></li><li> 50 U / ml IL-2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.) <ul><li> - Diluidas de un 200 UI / l de valores. Añadir IL2 a la cantidad deseada de los medios de comunicación justo antes del uso cada vez. </li></ul></li></ul> PBMC y el aislamiento de células NK <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Solución de Alsever (Sigma) </li><li> RosetteSep Humanos de Células NK enriquecimiento Cocktail (StemCell Technologies) </li></ul> Células NK Citotoxicidad de ensayo <ul><li> Calceína-AM (Invitrogen) <ul><li> Solución madre se encuentra en 1 mg / ml, tienda de congelados en alícuotas de 50 mL. Se disuelven en los medios de comunicación para lograr Nkem dilución deseada para la tinción de células. </li></ul></li></ul> Anticuerpos La lista de los anticuerpos utilizados para el fenotipo de las células NK se enumeran en la tabla siguiente; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticuerpo </td><td> Volumen por prueba </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Un tubo </td><td valign="top"> FITC isotipo FITC isotipo FITC isotipo FITC isotipo Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tubo 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tubo 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tubo de 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 APC CD27 Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tubo 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tubo de 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC Tampón FACS Volumen Total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

Asesinas naturales (NK) desempeñan un papel importante en la vigilancia inmune contra una variedad de microorganismos infecciosos y tumores. La limitada disponibilidad de las células NK y la capacidad de ampliar in vitro ha restringido el desarrollo de la inmunoterapia de las células NK. Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente grandes cantidades de células NK funcionales ex vivo utilizando células que expresan K562 membrana IL21, como artificial célula presentadora de antígeno (AAPC). Terapias de células NK adoptivos a la fecha han utilizado un producto de células obtenidas por el estado de equilibrio de la aféresis de donantes seguido por el agotamiento de las células T o de la selección positiva de las células NK. El producto se activa normalmente en IL-2 durante la noche y luego se administra el día siguiente 1. Debido a la baja frecuencia de las células NK en sangre periférica, un número relativamente pequeño de las células NK se han entregado en los ensayos clínicos. La incapacidad para propagar las células NK in vitro ha sido el factor limitante para la generación de un número suficiente de células para el resultado clínico óptimo. Algunos expansión de las células NK (50-10 veces más de 1-2 semanas) se logra a través de altas dosis de IL-2 sola 2. La activación de células T autólogas puede mediar la expansión de células NK, probablemente también a través de la liberación de citoquinas local 3. Apoyo con estroma mesenquimal o de células presentadoras de antígeno artificiales (aAPCs) puede apoyar la expansión de las células NK, tanto de sangre periférica y sangre de cordón umbilical 4. Combinado NKp46 y la activación CD2 por anticuerpos revestida de piedras se comercializan actualmente para la expansión de las células NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), lo que resulta en la expansión de aproximadamente 100 veces en 21 días. Los ensayos clínicos utilizando AAPC-expandido o activa las células NK están en marcha, uno con línea celular leucémica CTV-1 a las células NK y activar primer 5 sin una expansión significativa. Un segundo ensayo utiliza EBV-LCL para la expansión de las células NK, logrando una expansión media de 490 veces en 21 días 6. La tercera utiliza un AAPC K562 basado transducidas con 4 1BBL (CD137L) y 7 de membrana IL-15 (MIL-15), que alcanzó una expansión media de NK 277 veces en 21 días. A pesar de que las células NK ampliado con K562-41BBL-mIL15 AAPC son altamente citotóxicos in vitro e in vivo frente a dilatar las células NK, y participar en la ADCC, su proliferación se ve limitada por la senescencia atribuido a acortamiento de los telómeros 8. Más recientemente, una expansión de 350 veces de las células NK se informó mediante K562 expresan MICA, 4 y 9 1BBL-IL15. Nuestro método de expansión de las células NK se describe en este documento produce una rápida proliferación de las células NK, sin alcanzar la senescencia una expansión media de 21.000 veces en 21 días.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

47.9K vistas.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Video: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antígenos funcional protegido glóbulos rojos por la membrana injerto de compactos Poligliceroles hiperramificados

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

Aislamiento, activación y expansión de células T basadas en flotación a partir de muestras de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando microburbujas

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Diferenciación de osteoclastos funcionales de monocitos CD14+ de sangre periférica humana

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...