Este trabajo fue apoyado por el R01 DK078161 de NIDDK (LO), becas postdoctorales de la American Heart Association (AB), la Fundación Wenner-Gren de Suecia y Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suecia (UB). Apoyo adicional fue proporcionada por el Centro Médico de Maine instalaciones centrales del Instituto de Investigación para la histopatología, Bioinformática y FACS (apoyado por 2P20RR18789-06) y el Fondo para el Animal MMCRI.

1. Preparación de los reactivos para la digestión del Riñón <ol><li> 1,5 ml de 0,25% de colagenasa A (w / v) y una solución de pancreatina digerir% (w / v) serán necesarios para la extracción de células de la zona nefrogénica (NZCs) de 8 E17.5 riñones. Debido a la pancreatina de aproximadamente 2 horas para disolver a temperatura ambiente, lo suficiente para digerir la solución al mayor número de riñones embrionarios espera que debe hacer antes del experimento. Prepare una solución digerir primero la adición de 25 mg de colagenasa A 10 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (DPBS) en un claro de 15 ml, tubo de centrífuga estéril. Es muy importante que el DPBS no contiene calcio o magnesio, ya que esto interfiere con la digestión enzimática. Mezcle la solución en un nutator durante 10 minutos para disolver colagenasa A. Añadir 100 mg de pancreatina de colagenasa disuelto una solución y se mezcla en un nutator por lo menos 2 horas. Por otra parte, la colagenasa A / pancreatina solución de digestión se pueden mezclar en una nutator la noche a 4 ° C. Se recomienda que use una máscara, como la colagenasa A y pancreatina se dispersan fácilmente en la atmósfera durante el pesaje y puede irritar los conductos nasales. </li><li> Preparar un 5% de suero fetal bovino (SFB) (v / v) en solución salina tamponada de Hank (HBSS). Invierta para mezclar. 1 ml por cada tubo, de 8 de los riñones será necesario. </li><li> Preparar medio de cultivo de queratinocitos, completándolo medio libre de suero con 1% de glutamina (v / v) y el 1% penicilina-estreptomicina (Penstrep) (v / v). </li><li> Capa estéril de poliestireno de fondo plano placas de cultivo de tejidos (96, 48, 24 o 6 también) con la solución de fibronectina humana a una concentración de 5 mg por cm2 de superficie de crecimiento. 5 mg de polvo de fibronectina se resuspende en 5 ml de H 2 O. estéril Este se diluye 1:25 en DPBS estéril sin calcio ni magnesio y 250 ml se añade a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las placas se incuban con la solución de fibronectina a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de 1 hora a 4 ° C. Por otra parte, las placas pueden ser incubadas durante la noche a 4 ° C. La solución se aspira en una campana de flujo laminar antes de la adición de medio / las células. </li></ol> 2. Los riñones de disección y eliminación de cápsulas (Hecho a temperatura ambiente) <ol><li> En E17.5, el sacrificio de la madre con un procedimiento aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo, extirpar el útero, y colocarlo en una placa de Petri que contiene DPBS con calcio y magnesio. Bajo un microscopio de disección, el uso de fórceps de relojería para eliminar cada embrión en el útero y decapitar a cada embrión. Una vez que toda la camada y está fuera del útero, la transferencia de los embriones a una placa de Petri que contiene limpia DPBS suficiente con el calcio y el magnesio para cubrir completamente los embriones dejando tras de sí tanta sangre y restos de tejido como sea posible. </li><li> Con unas pinzas, hacer una incisión circunferencial en la pared abdominal del embrión a nivel del ombligo. A continuación, coloque el embrión en su espalda, el pasador hacia abajo en los hombros con un juego de pinzas, y quitar los órganos internos de los pulmones hasta la vejiga con el otro juego de pinzas. Con la práctica esto se puede hacer en un solo movimiento. Los riñones deben adjuntarse a la parte posterior de la masa de los órganos. Si los riñones no permanecen unidos a los órganos eviscerados, pueden ser cuidadosamente removida de la pared dorsal del cuerpo. Los riñones que han sido dañados durante el proceso de disección debe ser desechada, ya que va a contaminar el cultivo final con los tipos de células inapropiadas. </li><li> Suavemente se burlan de distancia de los riñones del resto de los órganos, teniendo cuidado de mantener los riñones conectados entre sí. Mantener el tejido entre los riñones con un juego de pinzas de agarre y de la glándula suprarrenal adjunta a uno de los riñones con las pinzas de otros. La glándula adrenal debe ser unido a la cápsula renal. Con cuidado, vaya a la glándula suprarrenal y la cápsula lejos de alrededor del exterior del riñón, de forma similar a pelar un plátano. Tenga cuidado de no dividir el riñón a la mitad, mientras se pelan, y asegúrese de no dañar el tejido renal por debajo de la cápsula. Retire con cuidado el resto de la cápsula, así como el uréter si todavía está conectado. Repita con el otro riñón. </li><li> Utilice una pipeta de corte para colocar los riñones en un tubo de poliestireno de 5 ml de HBSS. Repita los pasos 2.2 a 2.4 por cada embrión. Los riñones se pueden juntar 8 por tubo. Con la eliminación práctica de la disección y la cápsula se llevará a 2-3 minutos de cada embrión. </li></ol> 3. La digestión enzimática de los riñones (todas las medidas a temperatura ambiente a menos se indique lo contrario) <ol><li> Retire la solución HBSS de tubos de 5 ml que contienen los riñones con una pipeta evitando cuidadosamente el contacto con los riñones. Inmediatamente añadir 1,5 ml de colagenasa A / pancreatina solución de digestión en el tubo de 5 ml que contienen los riñones antes de pasar a la siguiente muestra. Repita este procedimiento para cada tubo de los riñones. </li><li> Se colocan los tubos con la enzima renal / digiere en un nutator en un pre-calentado incubadora a 37 ° C durante 15 minutos. 2 minutos antesfinalización de la digestión, añadir 3 l de DNasa (1 U / ml) a un nuevo tubo de poliestireno de 5 ml por cada digestión se realiza. </li><li> Quite rápidamente la digestión de la incubadora, añadir 75 l de FBS y se invierte tres veces para mezclar. Deje reposar en el banco durante 2 minutos. </li><li> La transferencia de 1,4 ml de la suspensión de células en el tubo de poliestireno de 5 ml que contienen DNasa (1 U / ml), dejando los restantes 0,2 ml de suspensión celular y los riñones por detrás. El extra 0,2 ml de solución se dejó contener impurezas tales como la matriz extracelular. </li><li> Mezcle la suspensión de células / DNasa en una nutator en un 37 precalentado ° C incubadora durante 10 minutos. </li><li> Eliminar rápidamente las suspensiones de células de la incubadora y la transferencia de cada uno a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Giro suspensiones celulares en microcentrífuga a 325 g durante 5 minutos. </li><li> Quitar el sobrenadante de pellet de células y resuspender pellet en 1 ml de 5% de SFB / HBSS, pipeteando arriba y abajo 5 a 6 veces. Cap cada tubo antes de pasar a la siguiente muestra. </li><li> Giro suspensiones celulares en una microcentrífuga a 325 g durante 5 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 0,5 ml de queratinocitos medio libre de suero (KSFM), con aditivos para cada tubo y el tubo de tapa antes de pasar a la siguiente muestra. Después de medio ha sido añadido a todos los tubos, suavemente resuspender cada pellet de células pipeteando arriba y abajo 5 a 6 veces con una micropipeta de 1 ml. Combine todas las suspensiones de células en un tubo de poliestireno de 5 fresca ml. </li><li> Humedecer previamente dos de 40 micras de células colador-caps colocado en un tubo de 5 ml de poliestireno de fondo redondo con KSFM por muestra. Pase suspensiones celulares a través de un tapón del filtro mediante la transferencia de células con una micropipeta de 1 ml. Evite tocar el filtro con la punta de la pipeta. Recoger el filtrado y repetir filtración a través de la tapa del filtro de segundo. Quite la tapa del filtro de células y reemplazar con una nueva tapa de un tubo de poliestireno normal 5 ml. </li><li> Recuento de células con un hemocitómetro o celulares cuenta-y las células de transferencia a los pozos de una placa de cultivo de la fibronectina recubierto con una densidad de 100.000-200.000 células por cm 2, según sea necesario diluir con KSFM con aditivos. Por lo general, se recupera aproximadamente 4.5x10 6 células de embriones por camada 10. </li><li> Se incuban las células en un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. </li><li> Permiten a las células para recuperarse y conectar de 2-4 horas en medio antes de la estimulación con reactivos adicionales. Estimular las células con el compuesto de interés de 1 a 48 horas. Purificar el ARN para análisis de PCR utilizando el kit Qiagen RNeasy Micro siguiendo las instrucciones del fabricante o siga las instrucciones para la inmunotinción con fluorescencia de las células. </li></ol> 4. Preparación de los reactivos para la fijación de las células y la inmunotinción <ol><li> Prepare un 4% PFA: Disuelva 4% de paraformaldehído en PBS (v / v) a 55 ° C con agitación periódica. Enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Esta solución es tóxico y debe ser desechado en recipientes de desperdicio. </li><li> Prepare una solución de permeabilización mediante la adición de Triton X-100 a PBS para obtener una solución al 0,3% (v / v). </li><li> Prepare una solución al 5% de bloqueo en PBS con suero de la misma especie que se utilizó para elevar el anticuerpo secundario que se utilizará. Por ejemplo, si se quiere detectar un anticuerpo de conejo contra el antígeno diana con un burro anti-conejo Alexa Fluor 568, prepare una solución de bloqueo con 5% de suero de burro. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Prepare una solución de anticuerpo primario mediante la adición de la concentración adecuada de anticuerpos contra el 5% de solución de bloqueo. </li><li> Prepare una solución de anticuerpo secundario inmediatamente antes del uso. Añadir anticuerpo conjugado con fluoróforo a una concentración recomendada por el fabricante junto con la nuclear DAPI de contraste y otros marcadores de orgánulos como phalloidin de solución al 5% de bloqueo. Si el almacenamiento es necesario, mantener la solución en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Prepare 50% de glicerol / PBS solución (v / v) para el almacenamiento de células inmuno-. Por otra parte, Vectashield se puede utilizar. </li></ol> 5. La fijación de las células y la inmunotinción <ol><li> El siguiente protocolo se ha diseñado para la fijación y la tinción de NZCs en una placa de 24 pocillos. Los volúmenes indicados se refieren a un solo pozo. Los reactivos deben ser cuidadosamente pipeta durante todos los pasos para evitar la separación de las células, y la agitación de placas no se recomienda en las etapas de incubación. </li><li> Retire con cuidado el medio con una micropipeta de 1 ml y añadir 0,5 ml de PFA al 4% de las células cultivadas adjunta. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente sin perturbaciones. </li><li> Quitar el 4% PFA y añadir 0,5 ml por pocillo de solución de permeabilización. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar la solución de permeabilización y enjuague suavemente dos veces con 0,5 ml de PBS por aclarar. </li><li> Añadir 0,5 ml de solución de bloqueo e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos. </li><li> Retire la solución de bloqueo y añadir 0,225 ml de solución de anticuerpo primario. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 2 horas o toda la noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo primario y ri suavementense dos veces con 0,5 ml de PBS por aclarar. </li><li> Añadir 0,225 ml de solución de anticuerpo secundario. Incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60 minutos. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo secundario y enjuague suavemente dos veces con 0,5 ml de PBS por aclarar. </li><li> Añadir 0,3 ml de 50% de glicerol / PBS solución (v / v) o Vectashield suficiente para cubrir el fondo de la superficie también. </li><li> Las celdas de imagen con microscopio de epifluorescencia o tienda envueltos en papel de aluminio a 4 ° C. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. NZCs fueron purificados a partir de E17.5 embriones, chapada a 200.000 células por cm 2 y se incuba a 37 ° C durante un total de 24 horas. Las células fueron fotografiadas por contraste de fases con un microscopio Leica DM IRB invertido antes de la tinción de inmunofluorescencia. (A) 20 veces vista fase de contraste de NZCs después de 24 horas en la cultura. (B) Las células fueron fijadas y teñidas con un conejo anti-PAX2 anticuerpo específico para células progenitoras de nefronas (rojo) y uno secundario Alexa Fluor 568 burro conjugado anti-conejo. Nota núcleos azules contrastados con DAPI. (C) Fase de 40X ver el contraste de un grupo de progenitores de nefronas (centro) después de 24 horas en la cultura. (D) de la imagen 40X NZCs aislado de LacZ + embriones de la cepa Foxd1 LacZ, que expresa β-galactosidasa bajo el control del promotor Foxd1. Foxd1 se expresa en la población de células del estroma en la zona nefrogénica de los riñones en desarrollo. Las células se tiñeron con la F-actina phalloidin marcador (Oregon verde primario conjugado), la nuclear tinte DAPI (azul) y de conejo anti-β-galactosidasa (secundaria - Alexa Fluor burro anti-conejo de 568) para la detección de las células del estroma Foxd1 + ( rojo).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

En este protocolo se describe un método para aislar y cultivar células de la zona nefrogénica del riñón embrionario. Es el desarrollo de un método publicado inicialmente como parte de un estudio de los efectos de BMP7 tratamiento de las células de la zona nefrogénica (al blanco y otros., 2009). En el estudio inicial, una serie de experimentos para caracterizar los tipos de células representadas en la población NZC se llevaron a cabo. En pocas palabras, la purificación de NZCs de los periodis...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

El desarrollo embrionario del riñón ha sido ampliamente estudiado como un modelo para la interacción epitelio-mesénquima en la organogénesis y para ganar la comprensión de los orígenes de la enfermedad renal congénita. Más recientemente, la posibilidad de dirigir ingenuo células madre embrionarias hacia destinos nefrogénica ha sido explorada en el campo emergente de la medicina regenerativa. Los estudios genéticos en ratones han identificado varios caminos necesarios para el desarrollo del riñón, y un catálogo global de la transcripción de genes en el órgano ha sido recientemente generada <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , proporcionando numerosas candidato reguladores de las funciones esenciales del desarrollo. Organogénesis del riñón de roedores puede ser estudiado en cultivos de órganos, y muchos informes se ha utilizado este enfoque para analizar los resultados de la aplicación de cualquiera de las proteínas candidatas o derribar la expresión de genes candidatos mediante siRNA o morfolinos. Sin embargo, la aplicabilidad de la cultura de órganos para el estudio de la señalización que regula la madre / la diferenciación de células progenitoras en comparación con la renovación en el riñón en desarrollo es limitado, como órganos cultivados contienen una difusión compacta de la matriz extracelular limitación de las macromoléculas y las partículas de virus. Para el estudio de la señalización celular eventos que influyen en la madre / nicho de células progenitoras en el riñón, hemos desarrollado un sistema de célula primaria que establece la zona nefrogénica o nicho de células progenitoras de la ex vivo de riñón en desarrollo en el aislamiento del inductor de la diferenciación del epitelio. Utilizando digestión enzimática limitada, las células de la zona nefrogénica puede ser liberado de forma selectiva el desarrollo de los riñones en E17.5. Después de la filtración, estas células pueden ser cultivadas en una monocapa irregular con las condiciones más favorables. Análisis de marcadores de genes demuestra que estos cultivos contienen una distribución de los tipos celulares característicos de la zona nefrogénica en vivo, y que mantienen la expresión adecuada del gen marcador durante el período de cultivo. Estas células son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, lo que facilita enormemente el estudio de los candidatos madre / progenitoras efectos sobre las células del regulador. Parámetros básicos de biología celular como la proliferación y muerte celular, así como cambios en la expresión de marcadores moleculares característicos de la nefrona células madre / progenitoras in vivo puede ser utilizado con éxito como los resultados experimentales. Trabajo en curso en nuestro laboratorio con esta nueva técnica de células primarias tiene como objetivo descubrir los mecanismos básicos que rigen la regulación de la auto-renovación versus diferenciación en nefrona células madre / progenitoras.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

En este informe se describe un método para el aislamiento y la cultura de los nichos de células progenitoras de los riñones de embriones de ratón que pueden utilizarse para estudiar las vías de señalización que regulan células madre / progenitoras de los riñones en desarrollo. Estas células cultivadas son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, que permite la manipulación eficiente de las vías de candidato.

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K vistas.  Maine Medical Center Research Institute. En este informe se describe un método para el aislamiento y la cultura de los nichos de células progenitoras de los riñones de embriones de ratón que pueden utilizarse para estudiar las vías de señalización que regulan células madre / progenitoras de los riñones en desarrollo. Estas células cultivadas son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, que permite la mani...

Video: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Investigación

Biología

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Aislamiento y cultivo de células embrionarias progenitoras aviar valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteína Aislamiento del desarrollo embrionario del corazón del ratón Válvula Región

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...