Nuestro método ayuda a generar y comprender los datos de expresión génica de tejidos complejos a nivel de una sola célula. Nuestro método se puede aplicar básicamente a cualquier tejido de la misma manera y conduce a datos de alta calidad con muy pocos artefactos relacionados con el protocolo. Janna Leiz y yo del laboratorio Schmidt-Ott presentaremos el protocolo.
Comience colocando el riñón en una placa de disección en frío y use un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar para obtener una rebanada media de uno a dos milímetros. Asegúrese de que la pieza de tejido contenga todo el eje corticomedular. Use tijeras y pinzas de microdisección para recortar cuidadosamente la corteza desde los lados de la pieza central.
Dentro de la pieza de tejido disecado, los tres segmentos de la corteza, la médula externa y la médula interna deben ser claramente visibles. Transfiera la pieza renal a la solución de estabilización de ARN previamente preparada e incube durante 24 horas a cuatro grados centígrados para evitar la degradación del ARN. Después de 24 horas, retire la solución de estabilización de ARN.
Retire cuidadosamente el exceso de solución con un papel de seda y guarde el pañuelo a menos 80 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Tome la pieza de riñón congelada y transfiérala a una placa de Petri de poliestireno preenfriada de 60 milímetros en hielo que contenga un mililitro de Nuclei Lysis Buffer 1, o NLB1. Pique los tejidos a fondo con una cuchilla de afeitar o bisturí.
Corte la punta de una pipeta de un mililitro y transfiera el tejido picado y el tampón al tubo del molinillo colocado en hielo. Asegurándose de que todas las piezas hayan sido transferidas, lave la placa de Petri de cinco a 10 veces con el tampón. Mueva lentamente el mortero A 25 veces hacia arriba y hacia abajo en el tubo del molinillo sobre hielo para homogeneizar la suspensión.
Pase el homogeneizado a través de un filtro de 100 micrómetros en un tubo de recolección de 15 mililitros preenfriado sobre hielo y lave el filtro con otro mililitro de NLB1. Lave el tubo del molinillo con tampón de lisis de núcleos EZ frío y deseche el tampón. Transfiera el homogeneizado de nuevo al tubo del molinillo y mueva lentamente el mortero B 15 veces hacia arriba y hacia abajo en el tubo del molinillo sobre hielo para homogeneizar la suspensión.
Transfiera el homogeneizado a un tubo de recolección de 15 mililitros preenfriado sobre hielo. Lave el tubo del molinillo con otros dos mililitros de NLB1 y asegúrese de transferir todos los fragmentos de tejido al tubo de recolección. Incubar el homogeneizado durante cinco minutos en hielo para lisar las células.
Pase el homogeneizado a través de un filtro de 40 micrómetros a un tubo de recolección de 15 mililitros preenfriado. Haga girar el tubo de recolección durante cinco minutos a 500 veces G a cuatro grados centígrados en una centrífuga con un rotor de cangilón oscilante. Mientras tanto, agregue una solución inhibidora de la RNasa a NLB2.
Retire el sobrenadante sin alterar la bolita. Resuspender cuidadosamente el pellet en cuatro mililitros de NLB2. Subponga cuidadosamente la suspensión con un colchón de un mililitro de tampón de gradiente de sacarosa.
Gire la suspensión a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga con un rotor de cangilón oscilante. Mientras tanto, agregue una solución inhibidora de la RNasa al tampón de suspensión de los núcleos. Después de la centrifugación, retire suavemente el tubo de recolección de la centrífuga, teniendo cuidado de no perturbar las dos capas al manipular el tubo de recolección.
Los restos celulares se pueden observar entre las dos capas. Retire el sobrenadante con cuidado, comenzando con los desechos. Retire el sobrenadante restante sin alterar el pellet de núcleos y resuspenda cuidadosamente el pellet en un mililitro de tampón de suspensión de núcleos.
Pase el homogeneizado a través de un filtro de 20 micrómetros en el tubo de recolección de clasificación celular activado por fluorescencia de cinco mililitros preenfriado. El número de genes se comparó con el número de transcripciones definidas por identificadores moleculares únicos y coloreadas por la fracción de lecturas mitocondriales para evaluar la calidad de los núcleos aislados. Se detectaron un total de 20.000 genes en 6.000 núcleos con 1.600 genes medianos y 2.800 identificadores moleculares únicos medios por núcleo.
Los patrones de expresión génica de marcadores enriquecidos con conglomerados se visualizaron utilizando un diagrama de puntos, y grupos de tipo celular en un gráfico de incrustación de vecino estocástico distribuido en t. Se calculó el porcentaje de cada tipo de célula y se utilizó para determinar la proporción de túbulos proximales a células gruesas de las extremidades ascendentes. Es fundamental trabajar a cuatro grados centígrados en todo momento y determinar la cantidad óptima de tejido en las ejecuciones de prueba para garantizar suspensiones de alta calidad y concentraciones óptimas.
