La activación de las células epiteliales parietales es un factor clave en el desarrollo de tejido cicatricial en el glomérulo del riñón. Usando este método, podemos estudiar los procesos celulares involucrados en esta activación y, con suerte, encontrar opciones de tratamiento para ralentizar o incluso detener la progresión de la enfermedad. La principal ventaja de nuestra técnica es que utilizamos células primarias que crecen directamente de los glomérulos aislados.
Después de liberar los riñones, como se describe en el manuscrito de texto, sostenga el riñón con los fórceps quirúrgicos y use otro par de fórceps para extraer las cápsulas renales. Después de esto, coloque los riñones en los pozos de una placa de cultivo de seis pozos que contengan dos mililitros de HBSS y coloque la placa de cultivo sobre hielo. Primero, transfiera los riñones a una placa Petri de 100 milímetros y use dos bisturíes para picarlos en trozos pequeños que son aproximadamente de uno a dos milímetros.
Mantenga las piezas renales picadas húmedas con HBSS. A continuación, coloque las piezas renales encima de un tamiz metálico de 300 micrómetros y presione el riñón a través del tamiz utilizando el émbolo de una jeringa de 20 mililitros. Enjuague repetidamente el tamiz con HBSS en el medio y utilice una pipeta serológica para recoger el flujo y transferirlo a un plato limpio de Petri.
Usa un bisturí para raspar todo lo que queda en la parte inferior del tamiz y transferirlo al homogenenato renal recogido. Enjuague el homogeneizar del riñón a través de un tamiz de 75 y 53 micrómetros con HBSS. A continuación, lave ambos tamices con HBSS para eliminar todas las estructuras más pequeñas.
Recoger las estructuras renales y el material que quedaba en los tamices lavando la superficie superior de cada uno con DMEM complementado con 20%suero de ternero fetal y transferir el material a los pozos de una microplaca de unión ultra-baja de seis pozos. Lleve la microplaca de unión ultrabajo a un microscopio de luz invertido y utilice una pipeta de 20 microlitros que se tomó para recoger glomérulos encapsulados o decapsulados. Después de atrapar un solo glomerulo en la punta de la pipeta, agregue un medio DMEM fresco sin material renal recogido en la misma punta de pipeta a un volumen de 20 microlitros.
Transfiera el glomerós único con el medio DMEM al centro de un pozo de una placa de cultivo celular de 24 pozos e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres horas para permitir la fijación del glomerós al centro del pozo. Después de la incubación, el glomérulo se unirá al centro del pozo. Añadir cuidadosamente 500 microlitros de medio basal endotelial complementado con un kit de factor de crecimiento y un adicional 5%FBS y 1%penicilina y estreptomicina a cada pozo.
Cultiva los glomérulos individuales a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante seis días. Después de seis días de incubación, utilice un microscopio de luz digital invertido para tomar imágenes y analizar el crecimiento glomerular. Con un software de análisis de imágenes, determine el área de superficie del crecimiento glomerular abriendo uno de los archivos de imagen con una barra de escala.
Dibuje una línea recta en la barra de escala y haga clic en Analizar y, a continuación, mida para determinar la distancia en píxeles. Para determinar la escala, haga clic en Analizar y establecer escala e introduzca la distancia conocida en píxeles, la distancia conocida y la unidad de longitud. Haga clic en Aceptar cuando haya terminado.
Haga clic en Analizar y establecer medidas. A continuación, compruebe las opciones de Etiqueta de visualización y área. Haga clic en Aceptar cuando haya terminado.
A continuación, dibuje una selección a mano alzada alrededor del crecimiento glomerular. Haga clic en Analizar y medir para mostrar una tabla de resultados, que contiene el área de superficie de crecimiento en la escala determinada anteriormente. en este estudio, los crecimientos de células epiteliales parietales glomerulares de glomérulos encapsulados se aíslan de los riñones de ratón, se cultivan y se analizan.
Las imágenes representativas de microscopía de luz muestran los crecimientos glomerulares en diferentes puntos de tiempo durante el cultivo después de que el glosulo está aislado de los riñones del ratón. Con el fin de validar que las células que crecen son células epiteliales parietales, los glomérulos decapsulados también se aíslan y se cultivan durante seis días. Los glomérulos decapsulados no muestran crecimiento celular durante este período de incubación.
A continuación, se realiza tinción inmunofluorescente para diferentes marcadores de células epiteliales parietales, marcadores específicos del sitio fotográfico, así como marcadores de células endoteliales. Los resultados validan que las células que crecen, de hecho, son células epiteliales parietales. Los glomérulos asociados a los ratones noqueadores CD44 muestran una disminución del número de células que crecen, así como una disminución del área superficial del crecimiento glomerular en comparación con los glomérulos aislados de ratones de tipo salvaje.
Esto sugiere un papel importante para CD44 en la activación de células epiteliales parietales. Usando esta técnica, también es posible estudiar los efectos sobre los fármacos en la activación de células epiteliales parietales. Esto se puede hacer mediante el tratamiento de los glomérulos aislados con el fármaco de su elección y para analizar las diferencias en el crecimiento celular y la migración celular.
