Reconhecemos o apoio da Escola de Ciência da Computação e Faculdade de Ciências, Agricultura e Engenharia da Universidade de Newcastle, pela Universidade Ulm, e pelo SciMedia Ltd (Tóquio, Japão).

1. Preparação do Caranguejo Sistema Nervoso Stomatogastric Adulto Cancer pagurus L. foram obtidas de fontes locais (Newcastle University, Dove Marine Laboratories) e mantidos em filtrada, a água do mar aerada (10-12 ° C). Animais foram anestesiados por embalagem-las em gelo por 20-40 min antes da dissecção. Usamos isolado stomatogastric sistemas nervoso (STNS) 1. O STNS foi preso em um elastômero de silicone revestido (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Munique, Alemanha), placa de Petri e continuamente superfused (7-12 mL / min) com solução salina refrigerada (10-13 ° C). Soro fisiológico consistiam (mMol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; trisma base, 10; ácido maleico, 5. Salina foi mantido a uma temperatura constante de 11-13 ° C e em pH 7,4-7,6. As etapas detalhadas da dissecção STNS e preparação, incluindo a desheathing do gânglio stomatoastric (STG), são apresentados no artigo JOVE por Guttierez e Grashow 1. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Directiva Europeia Conselho das Comunidades, de 24 de Novembro de 1986 (86/609/CEE). Figura 1A mostra um diagrama esquemático do STNS e Figura 1B mostra um típico STG desheathed ter seus neurônios dispostos como um semicírculo plana na parte posterior do gânglio. Placa de Petri com o STNS é fixo para a plataforma operacional do microscópio de imagem (BW51 WI; Olympus, Tokyo, Japan), com massa de modelar. Ambos, o estágio do microscópio e do microscópio são montados sobre uma mesa de vibração isolada (Scientifica, Uckfield, UK) para evitar artefatos movimento durante a gravação óptica. Os padrões motores gerados no gânglio stomatogastric (STG) são monitorizados usando gravações extracelular 2-4. Isto é feito através dos seguintes passos: <ol><li> Um compartimento vaselinas baseado cilíndrica é construído em torno de uma secção do nervo motor principal (lvn) para isolar eletricamente o nervo do banho (isto é feito no palco antes da dissecção placa de Petri é colocado sobre a plataforma operacional do microscópio de imagem ). </li><li> Um dos dois fios de aço inoxidável eletrodo é colocado neste compartimento, o outro no banho como um eletrodo de referência. </li><li> O sinal diferencial é gravado, filtrado e amplificado com um amplificador diferencial AC (Univ. Kaiserslautern, Alemanha). </li><li> A atividade motora do gânglio é monitorado usando um osciloscópio (DL708E; Yokogawa, Tóquio, Japão) e, adicionalmente, é gravado usando uma placa de aquisição de dados (Power CED, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) e os de Spike 2 v6.10 software (Electronic Design Cambridge, Cambridge, UK). Os arquivos são analisados ​​de Spike 2 v6.10 (Electronic Design Cambridge, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Preparação da solução corante Usamos o fluorescente sensíveis à voltagem corante Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, que tem uma carga positiva dupla que facilita o carregamento do corante através de microeletrodos usando pulsos de corrente positiva. A solução corante deve ser protegido da luz, tanto quanto possível. A solução corante é preparada como segue: <ol><li> 5 mg de corante é misturado com 1 mL de ácido F-127 PLURONIC em DMSO solução (Invitrogen). </li><li> O frasco de plástico contendo o corante dissolvido é centrifugado por 20 minutos a 12.000 rotação / minuto em microcentrífuga Sigma 14/01 (Sigma, Osterode, Alemanha) para separar as partículas maiores corante que pode obstruir os microeletrodos. </li><li> O sobrenadante (200 mL em cima) da solução de corante é separada usando uma pipeta e armazenado em um frasco plástico separado. Ambos os frascos estão envoltos em papel alumínio para evitar exposição à luz. </li><li> A solução corante é congelado a -20 ° C. </li><li> Antes de usar a solução de tintura é derretida, colocando o frasco fechado e envolto em água morna (25 ° C) de água por 10-15 minutos. </li></ol> 3. Corante por injeção intracelular utilizando Microeletrodos da Sharp Usamos microeletrodos afiada para carregar os neurônios com o corante. Para verificar a carga de corante que usamos o sistema de imagem MiCAM02 (SciMedia, Tóquio, Japão) 6. O sistema de imagem tem duas câmeras CCD: a câmera de RH tem um chip sensor maior (6,4 mm x 4,8 mm) proporcionando uma melhor resolução espacial com a melhor resolução temporal sendo 1,4 ms, a câmera HS tem um menor (2,9 mm x 2,1 mm), mas mais rápido do chip sensor de imagem mais rápido permitindo ter 0,7 ms como a sua melhor resolução temporal. As etapas do processo de carga de corantes são os seguintes: <ol><li> Microeletrodos são puxados com um P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EUA) extrator utilizando eletrodo 10 cm de comprimento, 1 mm tubos de diâmetro externo de vidro com filamento (GB100TF 8P, Produtos Ciência, Hofheim, Alemanha). Os eletrodos são puxados para ter uma resistência nofaixa de 25-40 MOhm em KCl 3M (para ajustes de parâmetros apropriados puxando seguir o livro de receitas pipeta fornecido pelo fabricante do extrator eletrodo). </li><li> A solução corante congelado é fundido e uma quantidade muito pequena do que é sugado para dentro de uma agulha Microfil (Microfil - 34G, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA) - o corante sugado enche cerca de 2 / 3 º da agulha Microfil . </li><li> A solução corante na agulha Microfil é injetado na ponta de um microeletrodo. O microeletrodo é colocado em uma caixa escura por 15 minutos. </li><li> O microeletrodo é backfilled com solução de KCl 3M. O eletrodo é então colocado de volta em uma caixa escura eletrodo de armazenamento para outro 10-20 minutos para permitir que a solução corante para alcançar a ponta fina do eletrodo pela sucção da força capilar atuando no microeletrodos. </li><li> O microeletrodo pronto é colocado em um porta-eletrodo e fixada na headstage do amplificador intracelular (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, EUA). </li><li> O amplificador intracelular está ligado à placa de aquisição de dados que fornece um sinal de pulso para conduzir pulsos de corrente para o microeletrodo. </li><li> O microeletrodo é colocado delicadamente na membrana de um neurônio STG usando um manipulador de microeletrodos (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK). Como a distância de trabalho da objetiva de 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 milímetros; Olympus Corporation, Tokyo, Japan) do microscópio de imagem é muito pequena, o microeletrodo deve ser posicionado em posição oblíqua (em torno de 30 °) eo movimento do microeletrodo na posição correta requer várias etapas de re-focalização da objetiva do microscópio e movendo o microeletrodo. Para iniciar o microeletrodo é movido em uma posição tal que sua ponta está acima da STG. A objetiva do microscópio é abaixado até a ponta do eletrodo aparece em foco. Então é ainda mais reduzido, mas não tanto para tocar o microeletrodo. O microeletrodo é reduzida até que reaparece no foco do objetivo. Estes passos são repetidos até que os neurônios aparecem claramente no plano de foco do objetivo. Em seguida, o microeletrodo é abaixada até tocar suavemente e perfura a membrana do neurônio STG selecionado. Este é monitorado usando o osciloscópio. </li><li> O eletrodo intracelular é usado para registrar a atividade do neurônio STG selecionados a fim de identificar o neurônio dado o seu perfil de atividade e da relação entre sua atividade ea atividade STG gravado a partir do eletrodo extracelular 2,3,7. </li><li> O amplificador intracelular está ligado em modo de injeção de corrente e é usado por 30 minutos para injetar 10 nA passos positivos atual no microeletrodo que duram um segundo e estão separados por um segundo, sem lacunas injetadas na corrente de microeletrodos. As unidades de corrente injetada as moléculas com carga positiva corante no neurônio gravado. Se o equipamento está disponível múltiplos neurônios podem ser injetadas simultaneamente. </li><li> Dez minutos para o período de injeção e após o final da injeção de corante a propagação dentro do neurônio está marcada. Para fazer isso usamos o sistema de imagem MiCAM02 (SciMedia Ltd, Tóquio, Japão) com o objetivo de 10x e iluminação pela ultra-low fonte de luz halógena ripple (HL-151; Moritex, Tóquio, Japão), através da MSWG2 cubo de filtro (com 480-550 nm de excitação do filtro; Olympus Corporation, Tokyo, Japan). O sistema de imagem está configurado para usar a câmera de RH com 192 pixels de resolução x 128, 40 ms de tempo de imagem, modo &#39;hbin&#39;, e 10 frames por sessão de imagem. Se o enchimento da tintura for bem sucedida a imagem deve mostrar um patch tingida na neurônio ao redor do local do microeletrodo, e este patch tingido deve crescer entre as imagens tiradas depois de 10 minutos e após 30 minutos. Se a difusão do corante é insuficiente após 30 min, mais tempo de injeção é concedido. Alternativamente, um eletrodo novo corante podem ser usados. </li><li> O eletrodo é puxado para fora do neurônio eo neurônio é deixado para descansar por pelo menos 20-30 minutos. Dentro deste tempo, o neurônio seguinte pode ser injetada com corante. </li></ol> 4. Imagem de Neurônios Pintado A atividade dos neurônios só podem ser visualizados após o procedimento de corante de enchimento. Alternativamente dois ou mais neurônios podem ser preenchidos para a imagem da atividade simultânea de vários neurônios STG. Em princípio, muitas e, possivelmente, todos os neurônios STG pode ser preenchido com corante. A imagem dos neurônios é feito com o sistema Micam 02 imagens usando a câmera de RH. O procedimento da imagem é a seguinte: <ol><li> A objetiva do microscópio é alterado e uma alta eficiência na transmissão da luz 20x objetivo (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 milímetros; Olympus Corporation, Tokyo, Japan) é utilizado para a coleta de dados de imagem. Este objectivo recolhe muito mais luz que a objetiva de 10x e também dá maior ampliação oferecendo uma imagem mais detalhada dos neurônios. Bein<html> g mais luz meio eficiente que a pequena quantidade de corante já é visível com este objetivo e também que podemos usar menor intensidade de luz para a imagem reduzir o dano potencial de fotos que podem ser causados ​​aos neurônios pelo corante. </li><li> Estágio do microscópio de operação é posicionada de tal forma que os neurônios que se destinam a ser trabalhada estão no campo de visão do objetivo eo objetivo é focada neles. </li><li> Os dados de gravação extracelular também é alimentado no sistema de imagem Micam 02 através do seu canal de entrada analógica. Isto permite o fácil relativamente relativas de sinais ópticos e padrões motores correspondente ou extracelularmente picos registrados na fase de análise. </li><li> A Micam sistema 02 é configurado para usar 96 x 64 pixels de resolução com 2,2 ms de tempo de imagens ou 48 x 32 pixels de resolução com 1,5 ms de tempo de imagens. Em ambos os casos o &quot;hbin&quot; configuração pode ser usado se o tingimento dos neurônios não é muito forte. </li><li> O nível de luz é definida o mais baixo possível (ou seja, a tintura nos neurônios deve gerar ainda fluorescência suficiente para a imagem) para evitar a foto de modulação e danos foto dos neurônios registrados. </li><li> A iluminação da sala e todas as fontes de luz restantes estão desligados. Além disso, uma cortina preta pode ser fechado em torno da plataforma de gravação para evitar exposição à luz de fontes externas. </li><li> As sessões de imagem são ajustados para ser entre 4-16 segundos de duração. </li><li> A atividade espontânea dos neurônios tingido é gravado em sessões de imagens diversas. </li></ol> 5. Análise dos dados de imagem óptico Para analisar os dados de imagem foi utilizado o software BVAna (versão 10,08; SciMedia Ltd, Tóquio, Japão) associado com o sistema de imagem Micam 02. O software suporta a visualização dos dados de imagem e oferece uma gama de ferramentas de análise também. Os passos da análise e interpretação dos dados são os seguintes: <ol><li> Uma região apropriada circular de interesse é selecionado em cada neurônios registrados. Normalmente usamos 2-3 regiões de pixel raio de interesse para a investigação de neurônios na 48 pixels de resolução x 32, e 6-8 regiões de pixel raio de interesse para a investigação de neurônios na resolução 96 x 64. </li><li> A suavização temporal dos dados pode ser necessário, especialmente se o corante gera valor relativamente baixo de fluorescência valor de fundo (baixo nos dados indica isso, que pode ser devido ao nível de pouca luz que é usado ou carregamento de corante de baixo nível, por exemplo em uma neurite do neurônio gravado). Normalmente, nesses casos, usamos suavização temporal com 3-5 unidades de tempo. </li><li> Além das gravações ópticas também mostrar a gravação extracelular selecionando para exibir a entrada analógica do sistema de imagens. </li><li> Os parâmetros para a visualização dos dados ópticos e de entrada analógica deve ser definida de forma adequada, a fim de ver todas as gravações na tela do computador. </li><li> Considerando-se as gravações ópticas dos neurônios, o registro extracelular do lvn, ea classificação do neurônio com base na gravação anterior intracelular, é possível determinar a identidade de um neurônio e relacionar sua atividade com as atividades neurais gravados a partir do nervosas. </li><li> Espera-se que as gravações ópticas mostram claramente, e sem a necessidade de uma média de mais vários eventos similares, as atividades neurais correspondentes aos picos registrados extracelularmente e também eventos subliminares tais como inibidores potenciais pós-sinápticos causados ​​pela atividade de outros neurônios. </li><li> As características dos dados de exportação do software BVAna pode ser usado para exportar as gravações ópticas calculadas para as regiões selecionadas de interesse e também a entrada analógica que contém a gravação do lvn. Os dados exportados podem ser processados ​​e analisados ​​utilizando o software de análise ainda outros dados, bem como (por exemplo, no caso mais simples Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA) pode ser usado para visualização e processamento de dados adicionais). </li></ol> 6. Resultados representante A Figura 2 mostra a gravação simultânea de dois neurônios (LP, lateral pilórica neurônio; PD, pyloric dilatador neurônio) no gerador de padrão pilórica central de um caranguejo STG juntamente com a gravação do lvn. As gravações ópticas dos neurônios LP e PD identificados com base em suas gravações intracelular mostram que na verdade correspondem a estas bem com as gravações extracelular correspondentes aos neurônios LP e PD. Há uma consistente 12 ms de atraso entre as gravações ópticas e lvn de picos de pico (veja inset da Figura 2) devido ao atraso de transmissão axonal entre o gânglio e no site a gravação extracelular. Os dados apresentados também mostra que a atividade neural na soma que corresponde aos picos dos neurônios gravado é facilmente detectável. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Um diagrama) esquemático do sistema nervoso stomatogastric (STNS). CoG gânglio, comissural; OG, gânglio de esôfago; gânglio STG, stomatogastric; stn, nervo stomatogastric; lvn, nervo ventricular lateral. B) O gânglio caranguejo stomatogastric (STG) - a imagem mostra o arranjo semicircular posterior de neurônios STG. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Varredura de gravação única simultânea de uma PD e um neurônio LP juntamente com a gravação do lvn. Os dados mostram que que as gravações óptico e nervo jogo muito bem e que podemos identificar as atividades neurais correspondentes aos picos registrados formam o nervo. A inserção mostra uma sobreposição de várias varreduras de potenciais de ação LP - tanto opticamente e eletricamente gravado - e sua média demonstrando a correspondência entre oticamente e atividades eletricamente gravado. Devido ao fato de que o nosso método de gravação óptica não filtrar os componentes de baixa freqüência dos dados que também são capazes de registrar alterações de membrana lento potencial característica para PD e LP neurônios 14.

<ol>
	<li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition.">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li><li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction.">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li><li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+dyes:+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes.">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure &#38; Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li><li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab,+Cancer+pagurus:+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination.">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li><li>Zecevic, D., Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., London, J. A., H&#246;pp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex.">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. 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Não há conflitos de interesse declarados.

O corante de tensão sensíveis imagem de 8,9 STG neurônios em combinação com os métodos tradicionais de eletrofisiologia (gravações eletrodo intra e extracelulares) permite uma melhor compreensão de como este pequeno e bem conhecido e ainda complexo funcionamento do sistema neural. O STG é um protótipo de gerador central de padrão (CPG) redes neuronais (que inclui as redes moinho gástrico pilórica e ritmo) 10, 11, assim, uma melhor compreensão das propriedades emergentes funcional do STG também ajudará a entender como, em geral, redes CPG gerar sua funcionalidade em nível de rede. CPG redes desempenham um papel crítico no controle motor 12 e também nas funções cognitivas superiores 13, conseqüentemente, a melhor compreensão de suas propriedades emergentes podem ter um grande impacto em muitas áreas da neurociência.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

Sensíveis à voltagem de imagens de corante de neurônios é uma metodologia chave para a compreensão de como as redes neuronais são organizados e como a atividade simultânea de neurônios participantes ocasiona o surgimento da funcionalidade integrante da rede. Aqui apresentamos a metodologia de aplicação desta técnica para os neurônios padrão identificado gerando no gânglio caranguejo stomatogastric. Nós demonstramos o carregamento desses neurônios com a fluorescente sensíveis à voltagem corante Di-8-ANEPPQ e mostramos como a imagem da atividade de corante neurônios carregados usando a velocidade MiCAM02 alta e alta resolução da câmera CCD do sistema de imagem. Nós demonstramos a análise dos dados de imagem gravados usando o software de imagem BVAna associado com o sistema de imagem MiCAM02. As imagens sensíveis à voltagem simultânea de corantes da atividade detalhada de múltiplos neurônios no gânglio de caranguejo stomatogastric aplicada juntamente com as técnicas tradicionais de eletrofisiologia (gravações intracelular e extracelular) abre radicalmente novas oportunidades para a compreensão de como padrão de trabalho gerador central de redes neurais.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Aqui apresentamos a metodologia para a rápida e de alta resolução de imagem sensíveis à voltagem corante fluorescente de atividade detalhada de neurônios no gânglio stomatogastric caranguejo.

Imagem óptica de neurônios no gânglio de Caranguejo Stomatogastric com Tensão sensível Corantes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K visualizações.  Ulm University. Aqui apresentamos a metodologia para a rápida e de alta resolução de imagem sensíveis à voltagem corante fluorescente de atividade detalhada de neurônios no gânglio stomatogastric caranguejo.

Vídeo: Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Neurociência

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.