Wir danken für die Unterstützung von der School of Computing Science and Faculty of Science, Landwirtschaft und Engineering von der Universität Newcastle, von der Universität Ulm, und durch die SciMedia Ltd (Tokyo, Japan).

1. Vorbereitung des Crab stomatogastrischen Nervous System Adult Cancer pagurus L. wurden aus lokalen Quellen (Newcastle University, Dove Marine-Laboratories) zu beschaffen und in gefiltertes, Porenbeton Meerwasser (10 bis 12 ° C). Die Tiere wurden durch die Verpackung sie in Eis für 20 narkotisierten - 40 min vor ihrer Zerlegung. Wir verwendeten isolierten stomatogastrischen Nervensystem (Tln) 1. Die Tln wurde in einem Silikon-Elastomer-ausgekleidete (ELASTOSIL RT-601, Wacker, München, Deutschland) Petrischale merken und kontinuierlich superfundiert (7 bis 12 mL / min) mit gekühlten Kochsalzlösung (10-13 ° C). Physiologische Kochsalzlösung bestand aus (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; Trisma Basis, 10; Maleinsäure, 5. 13 ° C und bei pH 7,4 - - 7,6 Saline wurde bei einer konstanten Temperatur von 11 gehalten. Die detaillierten Schritte der Tln Dissektion und Vorbereitung, einschließlich der desheathing der stomatoastric Ganglion (STG), sind in der JoVE Artikel von Guttierez und Grashow 1 dargestellt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) vorgenommen. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des Tln und Abbildung 1B zeigt eine typische desheathed STG mit seiner Neuronen als flache Halbkreis in den hinteren Teil des Ganglion angeordnet. Mit Knetmasse, die Petrischale mit dem Tln ist es, die operative Plattform der Imaging-Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan BW51 WI) fixiert. Sowohl die Mikroskoptisch und das Mikroskop auf einem schwingungsisolierte Tisch montiert (Scientifica, Uckfield, UK), um Bewegungsartefakte bei der optischen Aufzeichnung zu verhindern. Die Bewegungsmuster im stomatogastrischen Ganglion (STG) generiert werden anhand extrazellulären Aufnahmen 2-4. Dies wird durch die folgenden Schritte: <ol><li> Ein Vaseline-Basis zylindrischen Kammer ist um einen Abschnitt der wichtigsten motorischen Nerven (LVN) elektrisch zu isolieren den Nerv aus dem Bad (dies ist auf die Präparation der Bühne geschehen, bevor die Petrischale auf dem Betriebssystem-Plattform der Imaging-Mikroskop gelegt wird gebaut ). </li><li> Einer von zwei Edelstahl-Elektroden-Drähte in dieses Fach gelegt, die andere in das Bad als Referenz-Elektrode. </li><li> Das Differenzsignal wird aufgezeichnet, gefiltert und verstärkt mit einem AC-Differenzverstärker (Univ. Kaiserslautern, Deutschland). </li><li> Die motorische Aktivität der Ganglienzellen wird überwacht mit einem Oszilloskop (DL708E; Yokogawa, Tokyo, Japan) und wird zusätzlich aufgenommen mit einem Datenerfassungs-Board (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) und der Spike 2 v6.10 Software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Die Dateien werden analysiert mit Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). </li></ol> 2. Vorbereitung der Farbstofflösung Wir nutzten die fluoreszierenden Spannung Farbstoff Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, die eine doppelte positive Ladung, die die Beladung des Farbstoffes durch Mikroelektroden erleichtert durch positive Stromimpulse hat. Der Farbstoff-Lösung sollte vor Licht so weit wie möglich geschützt werden. Die Farbstofflösung wird wie folgt hergestellt: <ol><li> 5 mg des Farbstoffs ist mit 1 ml F-127 Pluronic Säure in DMSO (Invitrogen) gemischt. </li><li> Die Kunststoff-Fläschchen mit dem gelösten Farbstoff wird für 20 Minuten bei 12.000 zentrifugiert Drehung / Minute in einer Sigma Microcentrifuge 1-14 (Sigma, Osterode, Deutschland), um größere Farbpartikel, dass die Mikroelektrode verstopfen können zu trennen. </li><li> Der Überstand (top 200 ul) der Farbstofflösung wird anschließend über ein Pipette und in einem separaten Kunststoff-Fläschchen. Beide Flaschen sind in Aluminiumfolie ein, um Lichteinfall zu verhindern gewickelt. </li><li> Die Farbstofflösung wird bei -20 ° C eingefroren </li><li> Vor dem Einsatz der Lösung des Farbstoffes ist, indem die geschlossene und wickelte Fläschchen in warmen (25 ° C) Wasser für 10-15 Minuten geschmolzen. </li></ol> 3. Dye Loading durch intrazelluläre Injektion mit der Sharp Mikroelektroden Wir verwendeten scharfen Mikroelektroden an die Neuronen mit dem Farbstoff zu laden. Zur Überprüfung der Farbstoff Laden verwenden wir die MiCAM02 Imaging-System (SciMedia, Tokyo, Japan) 6. Das bildgebende System besteht aus zwei CCD-Kameras: Die HR-Kamera verfügt über einen größeren Sensor-Chip (6,4 mm x 4,8 mm) eine bessere räumliche Auflösung mit der besten zeitlichen Auflösung betrug 1,4 ms, hat das HS-Kamera eine kleinere (2,9 mm x 2,1 mm), aber schneller Sensor-Chip ermöglicht schnellere Bildgebung mit 0,7 ms as its best zeitlicher Auflösung. Die Schritte des Farbstoffes loading sind wie folgt: <ol><li> Mikroelektroden sind mit zog eine P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) Elektrode Abzieher mit 10 cm lang, 1 mm Außendurchmesser Glasröhrchen mit Filament (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Deutschland). Die Elektroden werden gezogen, um einen Widerstand in der habenSpektrum von 25 bis 40 MOhm in 3M KCl (geeignete ziehen Parametereinstellungen der Pipette Kochbuch von dem Hersteller der Elektrode puller vorgesehen folgen). </li><li> Die gefrorenen Farbstofflösung wird geschmolzen und eine sehr kleine Menge davon wird in eine Microfil Nadel (Microfil - 34G, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) - sog die angesaugte Farbstoff füllt rund 2 / 3 rd der Microfil Nadel . </li><li> Die Farbstofflösung in der Microfil Nadel wird in die Spitze einer Mikroelektrode injiziert. Die Mikroelektrode wird in einer dunklen Box für 15 Minuten gelegt. </li><li> Die Mikroelektroden ist mit 3M KCl-Lösung aufgefüllt. Die Elektrode wird dann wieder in eine dunkle Elektrode Aufbewahrungsbox für weitere 10-20 Minuten platziert, um die Farbstoff-Lösung ermöglicht die feine Spitze der Elektrode durch den Sog der Kapillare wirkende Kraft in der Mikroelektrode zu erreichen. </li><li> Die fertig Mikroelektroden in einem Elektrodenhalter gelegt und fixiert auf die headstage der intrazellulären Verstärker (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA). </li><li> Die intrazellulären Verstärker ist auf die Messkarte, dass ein Impulssignal an Stromimpulse in die Mikroelektroden-Laufwerk bereitstellt. </li><li> Die Mikroelektrode wird sanft in die Membran einer Nervenzelle STG mit einer Mikroelektrode Manipulator (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK) platziert. Da der Arbeitsabstand der 10fach Objektiv (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm; Olympus Corporation, Tokio, Japan) von der Imaging-Mikroskop ist sehr klein, sollte die Mikroelektrode in eine Schräglage positioniert werden (ca. 30 °) und die Bewegung der Mikroelektrode in die richtige Position erfordert mehrere Schritte der Neuausrichtung des Mikroskop-Objektivs und Bewegung der Mikroelektrode. Zum Start der Mikroelektroden ist in der Lage, so dass seine Spitze über dem STG bewegt wird. Die Mikroskop-Objektiv ist abgesenkt, bis die Spitze der Elektrode erscheint im Fokus. Dann ist es weiter, sondern senkte nicht so viel um die Mikroelektroden-Touch. Die Mikroelektrode wird abgesenkt, bis sie-re erscheint im Fokus des Objektivs. Diese Schritte werden wiederholt, bis die Neuronen klar erscheinen in der Fokusebene des Objektivs. Dann wird der Mikroelektroden ist abgesenkt, bis sie und berührt vorsichtig durchsticht die Membran des ausgewählten STG Neurons. Dies wird überwacht mit dem Oszilloskop. </li><li> Die intrazelluläre Elektrode wird verwendet, um die Aktivität der ausgewählten STG Neuron aufnehmen, um das Neuron aufgrund seiner Tätigkeit Profil und die Beziehung zwischen ihrer Tätigkeit und der STG-Aktivität von der extrazellulären Elektrode 2,3,7 aufgenommen zu identifizieren. </li><li> Die intrazellulären Verstärker ist in Stromeinspeisung umgeschaltet und wird für 30 Minuten zur 10 nA positive aktuellen Schritte in die Mikroelektroden, die zuletzt für ca. 1 Sekunde und 1 Sekunde Lücken sind derzeit keine Injektion in den Mikroelektroden getrennt zu injizieren. Der eingespeiste Strom treibt die positiv geladenen Farbstoffmoleküle in die aufgezeichneten Neuronen. Werden Geräte verfügbar mehrere Neuronen gleichzeitig injiziert werden. </li><li> Zehn Minuten nach der Injektion Zeitraum und nach dem Ende der Injektion der Farbstoff Ausbreitung des Neurons wird überprüft. Dazu verwenden wir die MiCAM02 Imaging-System (SciMedia Ltd, Tokio, Japan) mit dem 10-fach Objektiv und Beleuchtung durch den Ultra-Low-Ripple-Halogen-Lichtquelle (HL-151; Moritex, Tokyo, Japan) durch den Filter cube MSWG2 (mit 480-550 nm Anregungsfilter, Olympus Corporation, Tokio, Japan). Das bildgebende System ist auf die HR-Kamera mit 192 x 128 Pixel Auflösung, 40 ms Belichtungszeit, die &quot;hbin&quot;-Modus, und 10 Frames pro Imaging-Sitzung zu verwenden. Wenn der Farbstoff Befüllung erfolgreich die Bildgebung sollte einen gefärbten Fleck in das Neuron rund um den Standort der Mikroelektroden, und das gefärbte Pflaster sollte zwischen den Bildern nach 10 Minuten und nach 30 Minuten genommen werden. Wenn die Ausbreitung des Farbstoffes ist nach 30 min nicht ausreicht, ist mehr Einspritzzeit gewährt. Alternativ kann ein neuer Farbstoff Elektrode verwendet werden. </li><li> Die Elektrode wird aus dem Neuron gezogen und das Neuron bleibt für mindestens 20-30 Minuten entspannen. Innerhalb dieser Zeit kann das nächste Neuron mit Farbstoff injiziert werden. </li></ol> 4. Imaging von Dyed Neurons Die Aktivität der einzelnen Neuronen kann nach dem Farbstoff Füllvorgang abgebildet werden. Alternativ können zwei oder mehr Neuronen zu Bild gefüllt werden die gleichzeitige Aktivität von mehreren STG Neuronen. Im Prinzip viele und möglicherweise alle STG Neuronen kann mit Farbstoff gefüllt werden. Die Abbildung der Neuronen mit dem Micam 02 Imaging-System mit dem HR-Kamera gemacht. Das Verfahren der Bildgebung ist wie folgt: <ol><li> Die Mikroskop-Objektivs verändert wird und eine hohe Lichtdurchlässigkeit Effizienz 20x-Objektiv (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 mm; Olympus Corporation, Tokio, Japan) ist für die Bildgebung der Datenerhebung eingesetzt. Dieses Ziel sammelt viel Licht, dass die 10-fach Objektiv und auch höherer Vergrößerung gibt die detailliertere Bild der Neuronen. Bein<html> g mehr Licht effizient bedeutet, dass kleine Menge an Farbstoff Laden bereits sichtbar ist mit diesem Ziel und auch, dass wir geringere Lichtintensität für die Bildgebung eine Minderung der potenziellen Foto Schäden, die auf die Neuronen, die durch den Farbstoff verursacht werden können. </li><li> Das Mikroskop der operativen Phase wird so positioniert, dass die Neuronen, die gemeint, die abgebildet werden sollen, in das Sichtfeld des Objektivs sind und das Ziel ist auf sie konzentriert. </li><li> Die extrazelluläre Aufzeichnung von Daten ist auch in den Micam 02 Imaging-System durch seine analogen Eingangskanal eingespeist. Dies ermöglicht die relativ leicht über der optischen Signale und entsprechende Bewegungsmuster oder extrazellulär erfasst Spikes in der Analyse-Phase. </li><li> Die Micam 02-System ist auf 96 x 64 Pixel Auflösung mit 2,2 ms Belichtungszeit oder 48 x 32 Pixel Auflösung mit 1,5 ms Belichtungszeit verwenden. In beiden Fällen ist die &quot;hbin &#39;Einstellung kann verwendet werden, wenn die Färbung der Neuronen ist nicht sehr stark sein. </li><li> Die Lichtstärke ist so niedrig wie möglich (dh der Farbstoff in den Neuronen zu erzeugen noch ausreichende Fluoreszenz für die Bildgebung) eingestellt auf ein Foto, Modulations-und Foto Beschädigung der aufgezeichneten Neuronen zu vermeiden. </li><li> Die Raumbeleuchtung und alle übrigen Lichtquellen ausgeschaltet sind. Darüber hinaus kann ein schwarzer Vorhang um die Aufnahme rig geschlossen werden, um Belichtung aus externen Quellen zu verhindern. </li><li> Die Imaging-Sitzungen werden auf einen Wert zwischen 4 - 16 Sekunden lang. </li><li> Die spontane Aktivität der Neuronen gefärbt ist über mehrere Imaging-Sitzungen aufgezeichnet. </li></ol> 5. Die Analyse der Optical Imaging-Daten Zur Analyse der Bilddaten benutzten wir die BVAna Software (Version 10,08; SciMedia Ltd, Tokio, Japan) mit dem Micam 02 Imaging-System verbunden. Die Software unterstützt die Visualisierung der Bilddaten und bietet eine Reihe von Analyse-Tools sowie. Die Schritte der Datenanalyse und-interpretation sind wie folgt: <ol><li> Eine entsprechende kreisförmigen Bereich von Interesse ist auf jeden aufgezeichneten Neuronen ausgewählt. In der Regel verwenden wir 2 bis 3 Pixel Radius Regionen von Interesse für die Untersuchung Neuronen an der 48 x 32 Pixel Auflösung, und 6 bis 8 Pixel-Radius Regionen von Interesse für die Untersuchung Neuronen bei 96 x 64 Auflösung. </li><li> Die zeitliche Glättung der Daten erforderlich sein, insbesondere dann, wenn der Farbstoff relativ geringe Menge der Fluoreszenz (low Hintergrund Wert in die die Daten bedeutet dies, kann es aufgrund der geringen Lichtintensität, die verwendet wird oder niedrigen Niveau Farbstoff Laden, zum Beispiel in einem Neuriten der aufgezeichneten Neuron). In der Regel in solchen Fällen benutzten wir die zeitliche Glättung mit 3 bis 5 Zeiteinheiten. </li><li> Zusätzlich zu den optischen Aufnahmen haben wir auch Anzeige der extrazellulären Aufnahme, indem Sie auf den analogen Eingang des bildgebenden Systems anzuzeigen. </li><li> Die Parameter für die Visualisierung der optischen Daten und den analogen Eingang sollte entsprechend eingestellt werden, um alle Aufnahmen auf dem Bildschirm zu sehen. </li><li> In Anbetracht der optischen Aufnahmen der Neuronen, die extrazelluläre Aufnahme aus dem LVN, und die Klassifizierung des Neurons auf den früheren intrazelluläre Aufnahme basiert, ist es möglich, die Identität des Neurons zu ermitteln und deren Tätigkeit auf die neuronalen Aktivitäten aus den aufgezeichneten beziehen Nerv. </li><li> Es wird erwartet, dass die optischen Aufnahmen zeigen deutlich, und ohne die Notwendigkeit der Mittelung über mehrere ähnliche Ereignisse, die neuronalen Aktivitäten entsprechend extrazellulär erfasst Spikes und auch unterschwellige Ereignisse wie hemmenden postsynaptischen Potentiale durch die Aktivität anderer Nervenzellen verursacht. </li><li> Der Datenexport Merkmale des BVAna Software kann verwendet werden, um die optischen Aufnahmen für den ausgewählten Regionen von Interesse und auch den analogen Eingang, dass die Aufnahme aus dem lvn enthält berechnet exportieren. Die exportierten Daten können verarbeitet und analysiert werden weiter mit anderen Daten-Analyse-Software als auch (zB im einfachsten Fall Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) kann für zusätzliche Visualisierung und Datenverarbeitung verwendet werden). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt die gleichzeitige Aufnahme von zwei Neuronen (LP, seitliche Pylorus Neuron; PD, Pylorus Dilatator Neuron) in den Pylorus central pattern generator einer Krabbe STG zusammen mit der Aufnahme aus dem LVN. Die optischen Aufnahmen der LP und PD Neuronen auf der Grundlage ihrer intrazellulären Aufnahmen identifiziert zeigen, dass in der Tat diese Übereinstimmung auch mit der extrazellulären Aufnahmen entsprechend LP und PD Neuronen. Es ist eine konsequente 12 ms Verzögerung zwischen dem optischen und lvn Aufnahmen von Spike Peaks (siehe Einschub in Abbildung 2) durch die axonale Übertragung Verzögerung zwischen dem Ganglion und der extrazellulären Aufnahme vor Ort. Die vorgestellten Daten zeigen auch, dass die neuronale Aktivität in der Soma, die Spitzen der aufgezeichneten Neuronen entspricht eindeutig nachweisbar ist. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. A) Schematische Darstellung der stomatogastrischen Nervensystems (Tln). COG, kommissuralen Ganglion; OG, Schlundganglion; STG, stomatogastrischen Ganglion; stn, stomatogastrischen Nerven; lvn, lateral ventrikuläre Nerven. B) Die Krabbe stomatogastrischen Ganglion (STG) - das Bild zeigt die halbrunde Anordnung der hinteren STG Neuronen. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gleichzeitige Single Sweep-Aufzeichnung eines PD und eine LP Neuron zusammen mit der Aufzeichnung des LVN. Die Daten zeigen, dass die optischen und Nerven-Aufnahmen sehr gut passen und dass wir die neuronalen Aktivitäten entsprechend Spikes aufgezeichnet bilden die Nervenzellen zu identifizieren. Der Einschub zeigt eine Überlagerung von mehreren Sweeps von LP Aktionspotentiale - sowohl optisch als auch elektrisch aufgezeichnet - und deren durchschnittliche Nachweis der Übereinstimmung zwischen optisch und elektrisch aufgezeichneten Aktivitäten. Aufgrund der Tatsache, dass unsere optischen Aufzeichnungsverfahren nicht filtern die niederfrequenten Komponenten der Daten können wir auch zu langsam Membranpotential Veränderungen charakteristisch für PD und LP Neuronen 14 Eintragung.

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Die Spannung Farbstoff Bildgebung 8,9 von STG Neuronen in Kombination mit traditionellen Methoden der Elektrophysiologie (intra-und extrazellulären Elektrode Aufnahmen) ermöglicht ein besseres Verständnis davon, wie dieses kleine, bekannte und noch komplexe neuronale System funktioniert. Die STG ist ein Prototyp des central pattern generator (CPG) neuronalen Netzen (sie umfasst die Pylorus und Magenmühle Rhythmus Netze) 10,, 11, damit ein besseres Verständnis der entstehenden funktionellen Eigenschaften der STG auch helfen zu verstehen, wie im allgemeinen CPG-Netzwerke erzeugen ihre Netzwerk-Ebene Funktionalität. CPG-Netzwerke spielen eine entscheidende Rolle bei der Motorsteuerung 12 und auch in höheren kognitiven Funktionen 13, damit ein besseres Verständnis ihrer emergenten Eigenschaften haben einen großen Einfluss in vielen Bereichen der Neurowissenschaften.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
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optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

Voltage-sensitiven Farbstoff Bildgebung von Neuronen ist ein Schlüssel-Methode für das Verständnis, wie neuronale Netzwerke organisiert sind und wie die gleichzeitige Aktivität der beteiligten Nervenzellen führt zur Entstehung des integrierten Funktionalität des Netzwerkes. Hier präsentieren wir die Methodik der Anwendung dieser Technik zu identifizieren Muster erzeugenden Neuronen in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion. Wir zeigen das Laden dieser Neurone mit dem fluoreszierenden Spannung Farbstoff Di-8-ANEPPQ und wir zeigen, wie man Bilder die Aktivität der Farbstoff beladenen Neuronen mit dem MiCAM02 hoher Geschwindigkeit und hoher Auflösung CCD-Kamera Imaging-System. Wir zeigen die Auswertung der aufgezeichneten Bilddaten mit dem BVAna Imaging-Software mit dem MiCAM02 Imaging-System verbunden. Die gleichzeitige Spannungs-sensitiven Farbstoff Darstellung der detaillierten Aktivität mehrerer Neurone in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion angewendet zusammen mit traditionellen Techniken der Elektrophysiologie (intra-und extrazellulären Aufnahmen) eröffnet völlig neue Möglichkeiten für das Verständnis, wie central pattern generator neuronalen Netzen arbeiten.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Hier präsentieren wir die Methodik für schnelle und hochauflösende Fluoreszenz-Spannungs-sensitiven Farbstoff Bildgebung von detaillierten Aktivität von Neuronen in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K Aufrufe.  Ulm University. Hier präsentieren wir die Methodik für schnelle und hochauflösende Fluoreszenz-Spannungs-sensitiven Farbstoff Bildgebung von detaillierten Aktivität von Neuronen in der Krabbe stomatogastrischen Ganglion.

Serie: Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.