Damos las gracias a Steffen Koch por su apoyo técnico y Shannon Lee Layland (tanto Fraunhofer IGB en Stuttgart) por sus valiosas sugerencias sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado financieramente por el programa de Atracción de la Fraunhofer-Gesellschaft y el BMBF (tanto para KS-L.).

1. Preparación de la muestra biológica <ol><li> Preparación de las células vivas <ol><li> Preparación de células adherentes <ol><li> De semillas en las células cultivadas in vitro, o aisladas recientemente en un plato con fondo de cristal (Greiner BioOne / Alemania) y los incuban a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que la adhesión celular se ha completado. </li><li> Retire el medio de cultivo y lavar suavemente tres veces con PBS antes de la medición. Mantener las células cubiertas con PBS o medio de cultivo celular durante todo el procedimiento de medición. </li></ol></li><li> Preparación de las células en suspensión <ol><li> Separar in vitro células cultivadas de acuerdo con los protocolos comunes (por ejemplo, tripsina-EDTA, raspado de células), centrifugar las células y volver a suspender el sedimento celular obtenido en PBS o medio de cultivo celular. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión de células (concentración: máximo de 100.000 células / ml) a una placa inferior de vidrio. </li></ol></li></ol></li><li> Preparación de NATive tejidos <ol><li> Después de la cosecha de los tejidos, la transferencia a estéril, helado de PBS y mantenerlas no más de 12 horas a 4 ° C o sobre hielo antes de la medición. Experimentos previos han demostrado que un tiempo de almacenamiento prolongado (tiempo de isquemia fría&gt; 12 horas a 4 ° C) dio lugar a cambios espectrales debido a procesos de degradación naturales. </li><li> Las mediciones se realizaron con el tejido cubierto en PBS o medio para evitar el daño de las proteínas ECM y las células debido al secado del tejido. </li></ol></li></ol> 2. Espectrómetro Raman Nuestro espectrómetro Raman personalizado combina un microscopio de fluorescencia estándar (Olympus IX 71) con un espectrómetro Raman, que permite la comparación directa de las imágenes de campo claro y fluorescencia con el espectro Raman. La configuración básica consiste en un diodo láser 784 nm (Toptica fotónica AG / Alemania), un filtro de muesca para la separación de la luz Raman de dispersión de la luz de excitación, un microscopio unaª a. espectrógrafo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / EE.UU.) con un dispositivo de carga acoplada (CCD) optimizado para la detección de la información espectral (F-vista desde Soft Imaging Systems / Alemania) 3. Función de Control de láser <ol><li> Inicie el software de Andor Solís (Andor / Reino Unido) y ajustar la temperatura de la cámara CCD a -60 ° C para minimizar el ruido causado por las corrientes inducidas térmicamente en la cámara. </li><li> Colocar una oblea de silicio sobre la platina del microscopio para el procedimiento de calibración. </li><li> Encienda el láser y ajustar la potencia a 85 mW. </li><li> Utilice el software de la célula B (Olympus / Alemania) para enfocar el láser sobre la oblea hasta que aparece XY. </li><li> Medir la oblea de silicio con un tiempo de integración única de 1 seg usando un objetivo 60x aire. </li><li> Cambio de la unidad del eje X, del número de píxeles para cambio de Raman (cm -1) en el software de Andor Solís. </li><li> Variar el enfoque láser de silicio, el pico a 520 cm-1 enel espectro recogió el fin de encontrar la máxima intensidad posible para esta banda Raman. La cantidad mínima de recuento deberá ser superior a 11.000 para tener una calibración satisfactoria. </li></ol> 4. Las medidas espectroscópicas Raman Todas las mediciones se realizan a temperatura ambiente. <ol><li> Los ajustes básicos <ol><li> Utilizar un objetivo de inmersión en agua 60x (Olympus / Alemania) con una apertura numérica de 1,2 para recoger el espectro de las muestras. </li><li> Cambiar la configuración de adquisición a 10 integraciones / 10 segundos para un total de 100 segundos por mediciones. </li></ol></li><li> La medición de las células adherentes <ol><li> Toma el plato con fondo de cristal con las células y lo coloca en la platina del microscopio. </li><li> Con el fin de obtener una mejor señal y asegurar la reproducibilidad, enfocar el láser en el núcleo de la célula, apagar la luz del microscopio de fuera y empezar a cobrar el espectro. </li><li> Medir un espectro de referencia del fondo emuy 10 espectros moviendo el enfoque del láser al lado de la celda. Es importante tener en cuenta que al cambiar el foco de un nuevo fondo deben ser recogidos para cada profundidad de foco. </li></ol></li><li> Medición de las células en suspensión <ol><li> Transferir 100 l de la suspensión de células en el plato con fondo de cristal y colocarlo en la platina del microscopio. </li><li> Enfoque el láser en el centro de la célula, gire la luz del microscopio fuera y empezar a cobrar el espectro. </li><li> Medir un espectro de referencia del fondo cada espectros 10 moviendo el enfoque del láser al lado de la celda. Al cambiar el enfoque, un nuevo fondo deben ser recogidos por la profundidad nuevo enfoque. </li></ol></li><li> Medición de los tejidos nativos <ol><li> Tomar la muestra y colóquela en un plato con fondo de cristal. La región de interés (ROI) debe estar orientada hacia la parte inferior del plato. </li><li> Llenar el recipiente con suficiente PBS para cubrir la muestra. </li><li> Colocar una cubierta de vidrio sobre la muestra para evitar cualquier MOVement de la muestra durante las mediciones. </li><li> Establecer el enfoque del láser en la estructura de interés (resolución de profundidad es láser y el tejido-dependiente) y comenzar a recoger los espectros. </li><li> Recoger un espectro de referencia del fondo cada espectros 10 moviendo el láser se centran fuera del área de todo el tejido. Al cambiar el enfoque, un nuevo fondo deben ser recogidos por la profundidad nuevo enfoque. </li></ol></li><li> Medición de inmunofluorescencia (IF)-etiquetados cryosections <ol><li> Sección frescas, congeladas instantáneamente muestras de tejido usando un estándar de cryotom y montarlos en cubreobjetos recubiertos de sílice. </li><li> Mancha de los cryosections siguiendo un protocolo de rutina para SI, empleando solamente una etapa de fijación corto (máx. 10 minutos con paraformaldehído al 4%) y el uso de anticuerpos adecuados para la detección de la proteína de interés. </li><li> Realizar mediciones Raman centradas en el área donde se produce la fluorescencia. </li></ol></li><li> Elastina experimentos de degradación <ol><li> Place la ventricularis de los velos porcina disecados válvula aórtica (elastina-rica, la sangre entrada del lado de la capa de la valva de la válvula cardíaca) se enfrenta a la parte inferior de la placa inferior de vidrio. </li><li> Medir el tejido nativo como un &quot;no incubada control&quot; a los 30 puntos al azar a través de toda la superficie del tejido centrándose en las estructuras fibrilares. </li><li> Dividir la muestra en 3 secciones y las coloque en distintos tubos Eppendorf de 2,5 ml conteniendo 2 ml de una solución elastasa (5 U / ml, Worthington / Alemania). </li><li> Incubar el tejido, ya sea para 15 o 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Después de incubar durante 15 o 30 minutos, retirar los tejidos del tubo Eppendorf y lavar cuidadosamente con PBS con el fin de detener por completo la reacción enzimática. </li><li> Medir cada muestra en 30 puntos al azar, centrándose en las estructuras fibrilares. </li></ol></li></ol> 5. Procesamiento de Datos y Análisis <ol><li> Procesamiento de espectros Raman El pre-tratamiento delespectros generados se realizó utilizando el software OPUS (Bruker Optik GmbH / Alemania). <ol><li> Con el fin de reducir las señales de interferencia desde el cristal y medios, así como para evitar variaciones causadas por cambios en el foco durante las mediciones, restar el espectro de fondo correspondiente a partir de los espectros de recogida. </li><li> Reducir los espectros de la región entre el número de onda 400-1800 cm-1, que ofrece la mayor cantidad de información. </li><li> Si es necesario, para normalizar el espectro desde el pico máximo. La normalización de los factores de las fluctuaciones de intensidad y los fracasos sistemáticos, lo que simplifica la detección de cambios estructurales en los espectros de la muestra. </li><li> Lleve a cabo una corrección de línea de base para aumentar la comparabilidad entre los diferentes experimentos. </li></ol></li><li> Análisis de los espectros Raman Los espectros Raman fueron analizados mediante el PCA con el posicionador (CAMO / Noruega) de software. Este análisis multivariado detecta diferencias y similitudes dentro de los datos espectralesconjuntos. Cada espectro se representa en un solo punto en un espacio multidimensional basado en los recuentos obtenidos para cada turno de Raman. Cada componente principio (PC) describe una cierta cantidad de la información total contenida en los datos originales. El primer PC es la que contiene la mayor fuente de variación. Cada PC contiene las siguientes, en orden, menos información que la anterior. Cada variable tiene una puntuación y la carga de una en cada PC. Al graficar PC (= resultados), las correlaciones importantes de la muestra pueden estar expuestos. Las cargas de describir la contribución de cada variable analizada a la PCA. <ol><li> Escriba en cada grupo de medidas mediante la creación de rangos de filas para cada grupo de la muestra. </li><li> Use los siguientes ajustes básicos para la PCA: validación cruzada, el algoritmo NIPALS, sin rotación y comenzar el análisis. Estos ajustes son espectros dependiente. </li><li> Lleve a cabo el PCA. </li></ol></li></ol> 6. Los resultados representativos Raman spECTRA generado a partir de células adherentes a menudo revelan una baja relación señal-ruido y una baja intensidad de la señal global (Fig. 1). Debido al hecho de que el enfoque del láser tiene que ser situado cerca del fondo de cristal, la influencia de la interferencia 11 señal de vidrio es más bien alta, provocando enmascaramiento de la señal real de la muestra. En consecuencia, la señal de muestra puede ser minimizado o eliminado incluso durante un fondo posterior sustracción. Por lo tanto, preferimos utilizar células en suspensión para el análisis espectroscópico de Raman, ya que permiten la detección de más información espectral detallada. Sin embargo, los espectros de las células adherentes y la suspensión exhiben los mismos picos principales que sólo difieren en sus intensidades. Para la caracterización de diferentes tipos de células dentro de una suspensión, sin pre-tratamiento se requiere. Los espectros Raman media y las desviaciones estándar de los fibroblastos humanos, células madre mesenquimales (CMM), condrocitos y queratinocitos medido en suspensión sonrepresentada en la figura 2. Todos los espectros Raman tienen una estructura similar, con picos procedente de biomoléculas típicos tales como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos (ver Tabla 1). 12 Para estos tipos de células, la región espectral entre 600 y 1800 cm-1 contiene la información espectral más relevante, por claras diferencias que son detectables entre los diferentes tipos de células (Fig. 2A). Ejemplar, que puso de relieve una región espectral (1280-1350 cm-1) que muestra claras diferencias estructurales, que es asignable a las vibraciones moleculares de colágeno y los lípidos. En contraste, los análisis morfológicos no son adecuados para la identificación y distinción de la mayoría de las células (Fig. 2B-I). Mientras que la diferencia entre los condrocitos y células de la piel es observable (Fig. 2D, H versus B, F y E, I), fibroblastos y MSCs son difíciles de separar utilizando únicamente de campo claro micrsocopiar (Fig. 2B, C versus C, G) 13. El análisis espectroscópico Raman de tejido nativo, particularmente de las proteínas ECM, requiere que un ROI puede ser visualizada por brillante campo de la imagen con el fin de ser capaz de concentrarse en la estructura respectiva. Para la asignación de una proteína a un espectro de huellas dactilares específica, se generaron espectros Raman de proteínas puras comercialmente disponibles y cryosections inmunohistológicamente manchados. En este caso, hemos identificado los espectros de huellas dactilares de las fibras elásticas dentro de los tejidos nativos comparan elastina liofilizado e inmunofluorescencia manchadas de cryosections empleando un anticuerpo contra la elastina. Sin embargo, dado que la elastina presenta una autofluorescencia alta, lo cual se refleja en el espectro Raman, el análisis de datos es difícil (fig. 3A). Para reducir el fracaso sistemático debido a específicos en muestras propiedades tales como la autofluorescencia, un tratamiento apropiado de los conjuntos de datos es crucial. En nuestros datos unaalyses, hemos utilizado normalización para eliminar la intensidad de la señal significativamente mayor de la proteína pura elastina, y por lo tanto, hemos sido capaces de generar espectros Raman comparables (Fig. 3B). La elastina es una de las proteínas ECM más estables en el cuerpo y por lo tanto muy difíciles de degradar. 14 En nuestro trabajo experimental, que induce la degradación de la elastina en los folletos de salud porcina de la válvula aórtica mediante la realización de una digestión enzimática. Aplicando el análisis multivariado PCA, se identificaron diferencias significativas entre los espectros Raman de las muestras tratadas enzimáticamente y los controles nativos (Fig. 3C). Estas diferencias espectrales fueron observados en el espectro de carga a 861, 1003 y 1664 cm-1. Esperados cambios estructurales en las fibras que contienen elastina debido a los tiempos de exposición prolongados a la elastasa se ​​demuestra la tinción de HART (Fig. 4), que también se reflejaron en más grupos distintos puntuación separables (Fig. 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figura 1. La media de los espectros Raman de los fibroblastos independientes y adherentes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figura 2. (A) La media de los espectros Raman y las desviaciones estándar de cuatro diferentes tipos de células primarias aisladas (fibroblastos, MSC, los condrocitos y queratinocitos). El marco se destaca la región espectral de 1280 - 1350 cm-1 con las diferencias estructurales. (BE) de campo claro de imágenes separadas (B) fibroblastos, (C) MSCS, (D) los condrocitos y los queratinocitos (E). Barra de escala es igual a 20 micras. (FI) brillante campo de las imágenes de adherentes (F), los fibroblastos (G) MSC, (H) condrocitos (I) y queratinocitos. Barra de escala es igual a 200 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figura 3. (A) los espectros Raman, sin normalización de lyophiliZed elastina (línea azul), inmunofluorescencia (IF)-etiquetados cryosections (línea naranja) y fibras elásticas (línea roja) medidos en la válvula aórtica nativa folletos. La alta intensidad de señal de liofilizado elastina es causada por autofluorescencia. (B) espectro Raman después de la normalización con el fin de eliminar los fallos sistémicos. (C) Las puntuaciones y las cargas de la comparación entre el control no tratado (rojo) y enzimáticamente degradada (azul y verde) fibras elásticas en el tejido nativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figura 4. HART&#39;s manchados de porcinos valvas de la válvula aórtica. Las fibras elásticas se visualizan en negro. (A) y (B) muestran el control no tratado y (C) y (D) representan las muestras de tejido que fueron expuestos a la elastasa enzima que degrada la elastina de 30 minutos. <table border="1"><tbody><tr><td> Número de onda en cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Asignación de 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> NC </td><td> Los fosfolípidos </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> ADN / ARN bases, OPO espina dorsal </td><td> ADN / ARN </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> La fenilalanina </td><td> Proteína </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amida III </td><td> Proteína </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH $ 2 </td><td> Proteína / lípido </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amida IC = C </td><td> Lípidos y proteínas </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Bandas Raman que se detectan en los espectros de todos los tipos de células (fibroblastos, MSC, los condrocitos y queratinocitos).

<ol>
	<li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy.">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation.">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li><li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation.">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li><li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy:+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro.">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues:+implications+for+long-term+graft+durability.">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li><li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+secondary+radiation.">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12 (1928).</li><li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+scattering+of+collagen,+gelatin,+and+elastin.">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li><li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants.">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li><li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues.">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li><li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+component+analysis.">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Spectroscopy:+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells.">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li><li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy.">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+elastic+tissue+biology:+elastin+isolation+and+purification.">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives.">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li><li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues.">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures.">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La espectroscopía Raman es una herramienta adecuada para analizar muestras biológicas, tales como in vitro en cultivo células y proteínas ECM así como las células dentro de los tejidos nativos. 11,15,16 Aquí, hemos demostrado que este contacto no, etiqueta libre de la técnica permite discriminación de diferentes tipos de células y la detección de la degradación de proteínas ECM basada únicamente en la composición biomolecular intrínseca de estas muestras biológicas. La principal ventaja de la espectroscopía Raman es la capacidad de forma no invasiva cuantificar la huella bioquímica de una muestra por su espectro Raman resultante. En contraste con la espectroscopia infrarroja, que produce información similar, los espectros Raman puede ser recogida de muestras acuosas, como la dispersión Raman de agua es débil. Además, la espectroscopia Raman se basa únicamente en la detección de la retrodispersión de la luz monocromática, por lo tanto, no hay procesamiento de la muestra se requiere la medición anterior. Estos atributos hacen que Raespectroscopia de hombre una alternativa prometedora para el potencial en aplicaciones de imágenes in vivo. En este respecto, coherente anti-Stokes Raman (CARS) es una técnica muy interesante ya que permite la adquisición rápida y más sensible de los datos basados ​​en las mismas señales de vibración utilizados en nuestros experimentos. 15,16 Otros métodos alternativos como multifotónica inducida por autofluorescencia y formación de imágenes de segunda generación armónica han sido previamente demostrado ser adecuado para el seguimiento de muestras biológicas no invasiva o mínima. 17 Sin embargo, estas modalidades de imagen están asociados con costos muy altos y se limitan a autofluorescencia generadoras de moléculas. Además, el espectrómetro Raman es fácil de combinar con los microscopios ópticos convencionales. Estas características hacen de la espectroscopia Raman una herramienta valiosa para estudiar muestras biológicas en ambientes fisiológicos. Una de las limitaciones actuales de nuestra espectroscopia Raman es configurarel láser relativamente pequeño foco (250 nm completo máxima anchura media (FWHM) lateral y 700 nm FWHM axial) que es creado por un objetivo gran apertura numérica (NA = 1,2). Aunque una abertura numérica alta permite cubrir una buena cantidad de la luz emitida Raman produciendo en una alta relación señal-ruido, la alta NA produce sólo una pequeña colección de enfoque dentro de la muestra que es típicamente mucho más pequeña que una célula. Con el fin de comparar los espectros Raman de células diferentes, la colección de un espectro representativo es esencial, que es difícil de obtener con una pequeña zona de enfoque. Para solucionar este problema, estamos trabajando en un proceso para automatizar la recogida de la señal en diferentes puntos dentro de la célula (= espectroscopia Raman cartografía), lo que resulta en un promedio del espectro y la obtención de un espectro representativo. Además, esta técnica proporciona una visión general de la distribución de bandas específicas Raman, por ejemplo de la distribución de las proteínas dentro de una célula. Biol.muestras epidemiológicos completos son muy complejas y consisten en una mezcla heterogénea de biomoléculas que contribuyen a los espectros de recogida de Raman. Por lo tanto, el patrón espectral es muy complejo y el seguimiento de un solo tipo de una molécula dentro de un espectro Raman es difícil de lograr con la superposición de señales de moléculas diferentes. Adicionalmente, la fluorescencia intrínseca de la muestra puede enmascarar información valiosa de las señales más débiles Raman. Curiosamente, en algunos de nuestros estudios anteriores, hemos identificado autofluorescencia en los espectros Raman como el principal factor diferenciador entre los tipos de células (fibroblastos y MSC), utilizando una herramienta de análisis adecuado. 13 También se identificó que los cambios en la intensidad de la señal Raman en general puede servir como un indicador para el estado de colágeno y las fibras de colágeno dentro de la ECM de valvas de la válvula aórtica. 9 Sin embargo, al analizar el estado de la elastina en estos tejidos, que no fueron capaces de detectar resultados similares. Como se mencionó en el resultadola sección s, que sólo fueron capaces de detectar las alteraciones específicas de las bandas Raman en las muestras tratadas con elastasa en comparación con los controles nativos. No hemos visto una disminución de la señal Raman en general en las muestras tratadas enzimáticamente como se esperaba. Estas observaciones resultó en una parcela puntuación que no reveló una formación de agrupaciones clara como se ve en el estudio anterior. 9 En contraste, la influencia del tratamiento enzimático fue detectable dentro de los resultados de PCA. Suponemos que estas discrepancias entre las dos proteínas de matriz extracelular, la elastina y el colágeno, se basan en las diferencias morfológicas y diferentes procesos de degradación enzimática: dentro de la valva de la válvula aórtica, la zona rica en colágeno (fibrosa) es una capa continua que se afloja debido a la tratamiento enzimático, el cual contiene la elastina zona (ventricularis) tiene una configuración de red que aparece fragmentado después de la exposición a la elastasa (fig. 4). Las mediciones individuales al contado no eran por lo tanto, aprocomió para detectar tales rupturas pequeñas dentro de la red de elastina. Aquí, un mapeo de Raman del tejido podría ayudar a identificar las averías de la red. Otro desafío en la espectroscopia Raman de muestras biológicas es reducir los tiempos de medición. Una solución es aumentar la potencia del láser, que es adecuado siempre que las muestras biológicas no son afectadas por foto-daño. Todos nuestros experimentos actuales son la prueba de principio de los estudios centrados en la investigación básica, sin embargo, nuestro objetivo general es poner en práctica la espectroscopia Raman para aplicaciones clínicas, incluida la medicina regenerativa (por ejemplo, control de calidad de los productos de ingeniería tisular), pre-trasplante del injerto y la vigilancia el diagnóstico del cáncer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> elastasa </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anti-elastina anticuerpo </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampón citrato </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> platos de fondo de cristal </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> El Posicionador </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Las tecnologías no destructivas, sin contacto y libre de etiquetas para monitorear cultivos de células y tejidos se necesitan en el campo de la investigación biomédica. 1-5 métodos de rutina, sin embargo, disponibles en la actualidad requieren de pasos de procesamiento y alterar la integridad de la muestra. La espectroscopía Raman es un método rápido que permite la medición de muestras biológicas sin la necesidad de etapas de procesamiento adicionales. . Esta tecnología basada en láser detecta la dispersión inelástica de luz monocromática 6 Como cada vibración química se asigna a una banda específica de Raman (número de onda en cm -1), cada muestra biológica presenta un patrón típico espectral debido a su composición bioquímica inherente 7. - 9 Dentro de los espectros Raman, las intensidades de los picos se correlacionan con la cantidad de los enlaces moleculares presentes. 1 Similitudes y diferencias de los conjuntos de datos espectrales pueden ser detectados mediante el empleo de un análisis multivariado (análisis de componentes principales (PCA)) 10. </sup&gt; En este sentido, realizar la espectroscopia Raman de células vivas y tejidos nativos. Las células se sembraron en placas o bien con fondo de cristal, o mantenidas en suspensión en condiciones normales de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO 2) antes de la medición. Tejidos nativos se disecaron y se almacena en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C mediciones anteriores. En función de nuestro dispositivo experimental, entonces o bien se centró en el núcleo de la célula o de la matriz extracelular (ECM) de proteínas como elastina y colágeno. En todos los estudios, un mínimo de 30 células o 30 puntos al azar de interés dentro de la ECM se miden. Datos de los pasos de procesamiento incluye la sustracción de fondo y la normalización.

Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

La espectroscopia Raman es una técnica adecuada para el contacto no, libre de marca análisis de las células vivas, las construcciones de ingeniería de tejidos y tejidos nativos. Fuente específicos de huellas espectrales pueden ser generados y analizados utilizando el análisis multivariado.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K vistas.  Eberhard Karls University, Tübingen. La espectroscopia Raman es una técnica adecuada para el contacto no, libre de marca análisis de las células vivas, las construcciones de ingeniería de tejidos y tejidos nativos. Fuente específicos de huellas espectrales pueden ser generados y analizados utilizando el análisis multivariado.

Video: Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Investigación

Bioingeniería

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Preparación de la matriz extracelular fibras de proteína de Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricación de un hidrogel de derivados de matriz extracelular renal corteza

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementación de microscopía de reflexión de interferencias para imágenes de microtúbulos sin etiquetas y de alta velocidad

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

Captura óptica de nanopartículas plasmónicas para caracterizaciones de espectroscopía Raman mejorada en superficie in situ

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...