Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation con la subvención No. 0842736.

Introducción a la configuración de nuevos GFS Las EFP se compone de varios componentes esenciales: un microscopio de luz normal, una montura ecuatorial, una cámara y un ordenador [Figura 1]. El sellado de flujo células en la cámara que contiene la muestra es también indispensable de acuerdo con el diseño de las EFP. El microscopio de luz se monta en la montura ecuatorial por lo que el alcance se puede rotar en diferentes orientaciones en el espacio. Esta capacidad permite que el vector de la gravedad estática para ser explotados de manera que las muestras pueden ser de orientación dinámica en relación con el vector por lo que la fuerza de la gravedad puede impartir picoNewton alcance cargas de fuerza a las muestras. La cámara sustituye a la lente del microscopio óptico ocular de lo que se puede registrar los cambios en la orientación de la muestra. Estos datos en bruto es digitalizada y manipulada por la computadora para interpretar los datos en la fuerza real y las mediciones de distancia. El sellado de flujo cámara está diseñada para permitir a todos los grados de libertad en el espacio sin pérdida de muestra. Reside en la cámara de la molécula de la muestra que está atado cerca de una terminal a un &quot;ancla&quot; de cuentas que se pega a la superficie de la cámara. El término opuesto es atado a un &quot;móvil&quot; de cuentas que está libre de la superficie de la cámara. Este es el móvil de cuentas, libre en el tampón de ensayo que se puede actuar por la fuerza gravitacional se extiende por lo tanto la molécula atados a tales cargas de baja fuerza [Figura 2]. La muestra simplemente se ve como un par de microesferas bajo el microscopio, a pesar de que hace falta un poco de experiencia para discernir el bien útil, junto pares por su adhesión a una molécula de parejas donde ambos talones están sentados en la superficie de la cámara de flujo. Una de las modificaciones al sistema es la adición de una plataforma flotante que tiene la GFS y es suspendido por resortes. En esta configuración, una vez que la muestra se ha girado hacia una posición en la fuerza de la gravedad puede actuar sobre la muestra, la plataforma y todos sus componentes se pueden quitar en contra de la constante del resorte. Cerca de caída libre, la fuerza que actúa sobre el cordón de móviles es cercana a cero y en la extensión máxima de las aguas, la fuerza de gravedad se multiplica por hasta dos veces. De esta manera, una graduada de fuerza / distancia de respuesta pueden ser graficadas para medir el comportamiento de una sola molécula en diferentes cargas de fuerza. 1. Preparación de las microesferas <ol><li> Sumergir unos 10 mg de microesferas de vidrio o sílice en el 0,04% 3-aminopropiltrietoxisilano (corte con acetona) durante dos minutos. </li><li> Enjuague con dos cambios de agua destilada y se centrifuga para sedimentar a 2000 xg durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de acoplamiento (0,01 M piridina corte con agua destilada y ajustar el pH a 6.0) y agitar la mezcla vigorosamente. Centrifugar como se describió anteriormente. Repita este paso tres veces. </li><li> De torta húmeda de granos, agregar 2 ml de solución de glutaraldehído al 5% (corte glutaraldehído con tampón de acoplamiento). Agitar enérgicamente. </li><li> Bajo una campana, gire mezcla de grano / glutaraldehído durante 3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Centrífuga que el anterior, y aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavado de los granos en 5 ml de tampón de acoplamiento agitando vigorosamente y se centrifuga y se aspira el sobrenadante. Repite esto tres veces más. </li><li> Añadir alrededor de 15 ul del anticuerpo deseado a los granos y agitar vigorosamente. Las cuentas se deben rotar durante 16-24 horas. </li><li> Bajo el capó, agregar 5 ml de una solución de enfriamiento M glicina (glicina corte con agua destilada y ajustar el pH a 7.0). Agite la mezcla vigorosamente y girar durante 30 minutos. </li><li> Centrifugar y aspirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 5 ml de tampón de lavado (0,01 M Tris, pH 7,0; 0,1% de azida de sodio, 0,1% de BSA, 0,15 M NaCl y 0,001 M EDTA). Agitar enérgicamente este, se centrifuga y se aspira el sobrenadante. Repita este paso tres veces más. </li><li> Cambio de amortiguación de bajo contenido de sal tampón (0,1 M KCl, 0,02 M imidazol, 5 mM MgCl 2, ajustar a pH 7,0). Repita tres veces. </li></ol> 2. Muestra de apego a las microesferas <ol><li> Tomar una pequeña cantidad de cuentas preparados (alrededor de 2 l de cada una torta de cuentas sin embargo, si hay una gran discrepancia entre los lotes de diámetro, es conveniente utilizar en torno a una relación 8:1 de grandes cuentas pequeñas) y añadirlos a un tubo de microcentrífuga con tampón de ensayo. Reducir la concentración de las proteínas a alrededor de 5 M, con el tampón de ensayo. Preparar al menos un volumen total de 400 l como el buffer, la proteína, y las perlas. </li><li> Gire esta mezcla en torno a 1 RPM durante 3 horas (si la proteína se agita demasiado, que se agregan y se vuelven inútiles). </li></ol> 3. Preparación de diapositivas Cámara <ol><li> Capa de espesor un portaobjetos de microscopio con un 0,01% de nitrocelulosa (en acetato de amilo). Deje esta diapositiva en seco durante unos 10 minutos. </li><li> Con un cortador de vidrio afilado, corte tapa deslizante para hacer una cámara. Esto requiere de cuatro tiras de vidrio. </li><li> Usa el hecho deteoría borde de la copa y la comisión que a través de una mancha de grasa de vacío a ambos lados del borde. </li><li> Las tiras de prensa de grasa recubiertas nitrocelulosa seca cubierta de diapositivas para crear un cuadro en la superficie de la diapositiva. </li><li> Pipeta de 2 l de la mezcla de grano / proteína tocando pipeteador en la superficie de vidrio dentro de la caja. </li><li> Añadir alrededor de 20 a 400 l de buffer de baja en sal, dependiendo del tamaño de la cámara. </li><li> Pulse una hoja de la cubierta en la parte superior de la caja que ya está cubierto con grasa de vacío para finalizar la cámara sellada y protegida. </li><li> Dejó pasar sentarse en un lugar llano así que los granos tengan tiempo suficiente para anclarse a la nitrocelulosa. </li></ol> 4. GFS de Adquisición de Datos <ol><li> Montaje de diapositivas en la etapa de EFP </li><li> Controlar lo que la cámara está grabando GFS y la búsqueda de legítima &quot;pares de cuentas&quot;, en el que la microesfera delgado se une cerca del ecuador de la microesfera grande. </li><li> Cuando un par de bolas de potencial se encuentra, vaya a través de la profundidad de campo para determinar si el &quot;móvil&quot; de cuentas no se duerme en la superficie de la diapositiva. </li><li> Una vez que una pareja adecuada es identificado, tenga en cuenta el ángulo de cuentas móviles está lejos de max d (d max = la distancia máxima entre los centroides de las microesferas junto). Mueva el alcance en posición de adquirir video. </li><li> El ángulo de desplazamiento de la EFP debería ser suficiente para grabar d min, max d, y la vitamina D que se podría llamar de 25 a 90 grados, dependiendo de la longitud de la molécula. </li><li> RECORD como la pareja viaja de d a d min max y volver a d min. </li><li> Es una buena idea para filmar una película también de los antecedentes por lo que se puede restar más tarde para su análisis. </li><li> Si se realiza un descenso de EFP, mueva el alcance de nuevo a la densidad máxima y registrar la caída de por lo menos a 60 cuadros por segundo. La parte crítica es la primera oscilación, pero los tiempos largos de grabación también se puede utilizar para el estudio dinámico. </li></ol> 5. GFS de análisis de datos <ol><li> Transformar de vídeo en bruto en forma digital &quot;un umbral&quot; de la imagen y ejecutar macros en ImageJ para determinar la posición de centro de gravedad de cada cuenta en cada fotograma de vídeo. Esto también es para el vídeo de la gota. </li><li> Volcar la X, Y y los datos de área de ImageJ hacia Excel y representar los puntos. </li><li> Si un par de cuentas adecuada fue adquirido por el video, una joroba notable en el gráfico es un indicador de las cuentas que en su más cercano (d min) y en el vértice de la gráfica es la posición de d max. </li><li> Con estos datos, el radio de cada cuenta debe ser determinada con precisión en ImageJ y toda esta información se introduce en la ecuación anidados: d = [(g sen α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0,5 g = [d min 2 + r b 2 - (R a + r b) 2] = 0,5 r b sen β c = d max - r a - g (D = distancia entre centroides; g = fuerza de la gravedad; α = el ángulo en grados en paralelo a la lente del objetivo, r b = radio del móvil de cuentas, un r = radio de cordón anclado, el ángulo β = de unión fuera del eje de el ecuador de la anclado cuenta. </li><li> Utilizando el radio ajustado de la móvil de cuentas, que también da su volumen, y dada la densidad de la bola, la fuerza de la cuenta móvil imparte en la molécula se puede calcular en piconewtons después de la flotación del solvente se resta. Este método mide la fuerza de la molécula atados en piconewtons y calcula la longitud de la molécula absoluta entre los archivos adjuntos de anticuerpos en nanómetros. F = V (db) a (F = fuerza, V = volumen, d = densidad de las microesferas de vidrio, una aceleración = debido a la gravedad, b = la densidad del agua desplazada). </li></ol> 6. Los resultados representativos: Si la preparación de cuentas se hace correctamente, no habrá acumulación de cuentas mínimo, aunque todavía puede haber un grupo de bolas de vez en cuando. Cuando se ve a través del endoscopio, debe haber una distribución razonable de cuentas si emparejado o no en la cámara. Es importante para minimizar las vibraciones tanto como sea posible, para ello ya sea una mesa de aire, absorción de choque especial para los pies de un trípode que sostiene un montaje EQ, o en el sistema que utiliza muelles se puede utilizar para el aislamiento de vibraciones. Otro consejo útil sobre la cámara de flujo cerrado es dejar reposar durante unos cinco minutos en una mesa de nivel después de haber sido totalmente construido. Esto permite que las bolas sueltas mayor a flotar a través de la memoria intermedia y el resto de la capa de nitrocelulosa. Si la tapa se monta en lugar directamente sobre la terminación, el investigador continuamente tienen que lidiar con los granos, literalmente, volando por el campo de visión, y si esto ocurre durante la adquisición de vídeo se puede corromper ªe experimento. Si esto se hace correctamente, la fuga de cordón es mucho más limpio y minimiza los resultados de vídeo. Cuando un par de bolas potencial es identificado por el operador de EFP, es útil para poner a través de una rotación preliminar para vigilar el comportamiento de la pareja. Rara vez, la cuenta grande no está firmemente adherida a la diapositiva. Si esto sucede, no hay uso en la utilización de la pareja, ya que es fundamental que la mayor estancia cordón anclado en una posición fija durante la duración de la adquisición. Si la pareja es estable y no presenta &quot;rollo de cordón anclado&quot;, entonces es adecuado para la experimentación. Un gráfico de distancias de separación de cuentas frente a cambio en el ángulo con respecto a la gravedad se puede utilizar para evaluar los datos adquiridos. Un buen representante resultado mostraría poca separación en una meseta y como la cuenta móvil se libera de la cuenta anclado a causa de la influencia de la gravedad, el gráfico muestra una mayor separación. Esto continúa hasta que un buen pico se alcanza lo que se llama d max y la curva empieza nuevamente a la baja de regresar a la línea de base d min [Figura 1]. En condiciones ideales, esta firma es simétrica. Un resultado no sería representativa muestra un gráfico con los patrones incoherentes que no muestran distintas d min-max d-d patrón min, o sería una muestra de separaciones que son órdenes de magnitud demasiado elevada para una sola molécula que indica que tal vez había una mota de polvo entre las cuentas, o tal vez que el cordón de móviles no se sujeta fácilmente a todos. El proceso de encontrar el par, el tiro que, procesarla, analizarla y tiene muchos vacíos que deje inadecuado pares de cuentas son sacrificadas a cabo. Así que, si llega al final de todo el proceso y tiene una longitud de la molécula que sea consistente con los resultados anteriores, se puede estar muy seguro de que el par de bolas original es representativa y se pueden incluir en los resultados. En un buen día, aproximadamente la mitad de la toma pares de cuentas se pueden tomar a través de convertirse en un punto de datos legítimos. Por ejemplo, la longitud de la espiral de la bobina de la miosina entre MF20 MF30 y anticuerpos, que se conoce sobre la base de datos de EM y AFM, los datos de acercarse a 100 nm 2,7,8,9. Si el resultado es varias veces esta longitud, la muestra ha agregado. Los resultados presentados aquí son de los experimentos estándar de rotación GFS y demostrar una distancia de 96 nm ± 5 nm, [Figura 2], que está de acuerdo en estrecha colaboración con las mediciones de la MF30 (que se une a la N-terminal de la miosina subfragmento-2) y MF20 (que se une en el meromiosina luz) de distancia de separación de anticuerpos en la miosina deduce de los valores de la literatura [Figura 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. GFS configuración. Las partes principales de GFS están etiquetados. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema de principio de EFP. El lado izquierdo muestra centroide del cordón móvil a una distancia mínima de centro de gravedad de cordón anclado. Como EFP se gira, móviles de cuentas se alinea con vector de la gravedad que también está en paralelo con el eje de la molécula atados. En esta posición, la distancia entre los centroides de las cuentas móviles y anclada es máxima. Arriba a la derecha muestra una parte representativa de una película de GFS. Abajo a la derecha es una imagen de la rotación GFS sometidos. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Figura 3" /> La figura 3 muestra resultados Representante min d a la izquierda del gráfico;. D max con una separación relativa de 17,78 micras, y un retorno a la vitamina D en torno a la línea de base de alrededor de 17,75 micras de separación relativa entre las cuentas. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Representante resultado del experimento de rotación GFS muestra la distancia entre el MF20 y MF30 anticuerpos promedio de 96 nm. Esto representa la duración aproximada de S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Miosina II dímero utiliza para mostrar los archivos adjuntos posible para su uso con el sistema de EFP como anticuerpos y / o anexos de actina. Diferentes posibilidades de fijación permite diferentes estrategias de EFP para medir las diferentes regiones, o aplicar fuerza perpendicular o paralelo al dominio de la barra del dímero miosina.

<ol>
	<li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure.">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li><li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin.">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li><li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers.">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li><li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin's+50+kDa+cleft.">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li><li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+manipulating+individual+protein.">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li><li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments:+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin.">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li><li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment.">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li><li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer.">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li><li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface.">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li><li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy.">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li></ol>

Al convertir una película a una representación digital de un umbral, es crucial para la imagen de un umbral para mantener la misma área en cada fotograma de vídeo. Debido a que las cuentas en un par de bolas se mueven independientemente uno del otro, la deriva en las áreas de un umbral también puede causar la distancia relativa entre los centroides de las cuentas a la deriva y introducir un error considerable. El control de la zona del umbral reducido el error de cinco veces en las mediciones de distancia de 26 nm...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

El estudio de la estructura macromolecular ha convertido en crítico para la elucidación de los mecanismos moleculares y la función. Hay varios bioinstruments limitada, pero importante, capaz de probar la dependencia de la fuerza de las características estructurales de las proteínas. Escala ha sido un parámetro de limitación en la precisión investigadores pueden mirar en el mundo nanomecánicos de moléculas, tales como ácidos nucleicos, enzimas y las proteínas motoras que realizan para mantener la vida de trabajo. Microscopía de fuerza atómica (AFM) está bien afinado para determinar las estructuras nativas de proteínas fibrosas con una resolución de la distancia a la par con el microscopio electrónico. Sin embargo, en estudios de AFM fuerza, las fuerzas son generalmente mucho mayor que una sola molécula puede experimentar 1, 2. Trampas ópticas (OT) son muy buenos en la determinación de la distancia relativa entre los granos atrapados y pueden transmitir fuerzas muy pequeñas 3. Sin embargo, no precisa el rendimiento longitud absoluta de las moléculas bajo estudio. Simulaciones moleculares proporciona información de apoyo para estos experimentos, pero están limitados en la capacidad de manejar el mismo de gran tamaño molecular, cuadros de largo tiempo, y convencer a algunos investigadores, en ausencia de otras pruebas de apoyo 2, 4. La fuerza gravitacional del espectrómetro (GFS) llena un nicho importante en el arsenal de un investigador al ofrecer una combinación única de habilidades. Este instrumento es capaz de generar fuerzas típicamente con un 98% o mayor precisión de la gama femtonewton a la gama nanonewton. Las mediciones de distancia en la actualidad son capaces de resolver la longitud molecular absoluta a cinco nanómetros, y la relativa distancia de separación de cuentas par con una precisión similar a una trampa óptica. Además, la GFS puede determinar el estiramiento o desenrollar en donde la fuerza está cerca del equilibrio, o proporcionar una fuerza gradual de yuxtaponer contra cualquier cambio estructural medido. Incluso es posible determinar el número de residuos de aminoácidos están involucrados en desenrollar eventos bajo cargas de fuerza fisiológica 2. A diferencia de otros métodos de calibración donde hay fuerza amplia que debe preceder a cualquier ensayo, el GFS no requiere de calibración tal fuerza 5. Al complementar las fortalezas de otros métodos, la EFP cerrar las brechas en la comprensión de la nanomecánica de proteínas vitales y otras macromoléculas.

Watch this Scientific Journal Video about Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins at JoVE.com

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Se trata de un paso a paso guía que muestra el propósito, el funcionamiento y los resultados representativos de la fuerza de la gravedad del espectrómetro novela.

Demostrando la Utilización del Espectrómetro de Novela de la Fuerza gravitacional para estirar y medir las proteínas fibrosas

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K vistas.  University of North Texas. Se trata de un paso a paso guía que muestra el propósito, el funcionamiento y los resultados representativos de la fuerza de la gravedad del espectrómetro novela.

Video: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

El crecimiento del axón Tramo: El Mecanotransducción de crecimiento neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ carga de compresión y de imágenes no invasiva correlativa del hueso-ligamento periodontal de dientes fibroso Conjunta

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimática Ensayo para medir la transcripción Inhibición por galio (III) y H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

La recuperación de fluorescencia después de combinar una gotita de medir la difusión de dos dimensiones de un fosfolípido monocapa

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocidad Espectrómetro Sub-GHz para el Análisis de Dispersión de Brillouin

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...